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Qu'est-ce qu'un protocole simple pour colorer des cellules en suspension ?


Je suis un étudiant ingénieur étudiant comment les champs électriques affectent les cellules, en particulier les phénomènes d'électroporation dans les cellules vivantes.

Je sais que l'électroporation est largement utilisée pour introduire des gènes dans les cellules, mais mener une expérience de transfection complète n'est pas si faisable dans le laboratoire dans lequel je travaille.

Ma question est:

Si je veux démontrer le principe de l'électroporation, c'est-à-dire que les cellules s'ouvrent et absorbent des substances de l'environnement, en utilisant une sorte de colorant que je peux visualiser plus tard, quel pourrait être un bon modèle pour ce type d'expérience ? Plus précisément - quel colorant, quelles cellules pourraient être utilisées pour cela ?


Vous obtiendrez beaucoup de faux positifs en utilisant la méthode suivante, et une vraie transfection d'une protéine fluorescente est toujours la voie à suivre, car vous prouverez alors que la transfection a vraiment réussi.

Cela dit, vous pouvez essayer d'utiliser le DAPI, suivi d'une microscopie à fluorescence ou d'une cytométrie en flux. Le DAPI est un colorant très brillant pour l'ADN et ne peut pas traverser une membrane cellulaire intacte. Si la membrane cellulaire est rompue, par ex. g. par nécrose, le DAPI entrera dans la cellule. Je n'ai jamais vu personne essayer de prouver l'électroporation de cette façon, mais cela vaudra la peine d'essayer. Il se peut que le temps soit trop court pour que DAPI entre dans la cellule, vous devrez donc modifier votre configuration.

J'essaierais ce qui suit : préparez une solution cellulaire avec du DAPI (une concentration de 5 µM devrait faire l'affaire). Divisez la solution en deux cuvettes d'électroporation, effectuez l'électroporation avec une cuvette, laissez la seconde intacte comme contrôle. Après l'électroporation, analyser les échantillons MOMENTAREMENT (c'est-à-dire : en quelques minutes) à l'aide d'un cytomètre en flux (si possible).

Quant aux cellules, vous pouvez utiliser n'importe quoi. Je suggère les cellules eucaryotes car elles sont plus faciles à visualiser que les bactéries. Cependant, vous auriez besoin d'une hotte à flux laminaire pour la manipulation aseptique des cellules. En théorie, vous pouvez également utiliser des bactéries, qui sont plus faciles à manipuler, mais je n'ai pas l'expérience de l'immunofluorescence chez les bactéries.


Protocole de coloration cellulaire pour la microscopie

La microscopie fait référence à la pratique qui implique l'utilisation d'un microscope dans le but d'observer des structures à petite échelle qui ne peuvent pas être vues à l'œil nu et souvent la coloration des cellules est nécessaire car les structures sont difficiles à discerner en raison d'un contraste insuffisant.

La coloration cellulaire est une technique utilisée dans le but principal d'augmenter le contraste en changeant la couleur de certaines des parties de la structure observées, permettant ainsi une vision plus claire. Il existe une variété de colorants qui peuvent être utilisés en microscopie.

Tout d'abord, la coloration peut être in-vivo ou in-vitro. La différence entre ceux-ci est que, alors que la coloration in vivo fait référence à la coloration d'une matière biologique alors qu'elle est encore vivante, la coloration in vitro fait référence à une technique de coloration où la matière biologique est non vivante.

Voici des taches courantes expliquant les techniques, les préparations et les procédures pour chacune :

Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine

Il s'agit de deux colorations utilisées dans l'examen de fines tranches de tissu biologique. Le contraste est créé par les taches où l'hématoxyline rend les noyaux bleus tandis que l'éosine rend le cytoplasme ainsi que d'autres parties roses ou rouges.

1- Mesurer 10 grammes de cristaux d'hématoxyline 500 ml d'eau (70-80 degrés centigrades) et mélanger pour diluer complètement

2- Dans un flacon séparé, mesurer 20 grammes d'alun et mélanger avec 500 ml d'eau chaude du robinet (70-80 degrés)

3- Mélanger les deux mélanges ensemble (1 et 2)

Alors que l'alun est le mordant, le thymol empêche la croissance fongique.

5- Le mélange est ensuite conservé dans un flacon translucide à l'abri de la lumière directe du soleil pendant une semaine. Celui-ci est recouvert d'une serviette en papier qui permet la circulation de l'air (maturation précoce). La solution est ensuite placée dans un flacon sombre et bien fermée au bout d'une semaine, et conservée dans un endroit sombre pendant 3 semaines. (Mûrissement tardif)

1- Mesurez 10 grammes de cristaux d'éosine et ajoutez-les pour mélanger dans 1000 ml d'eau chaude du robinet (70-80 degrés). Cela doit être mélangé pour diluer et conservé dans un flacon sombre. Cela peut être utilisé directement.

1- Une coupe réhydratée est colorée dans une solution d'hématoxyline pendant 20 à 40 minutes

2- La section est ensuite lavée à l'eau du robinet pendant environ 3 minutes jusqu'à ce qu'elle devienne bleue,

3- La section est différenciée en éthanol à 70% qui contient 1% de HCL pendant environ 5 secondes pour éliminer l'excès de colorant et permettre au nucléaire d'émerger,

Celui-ci est ensuite lavé à l'eau du robinet,

5- Colorer à l'éosine pendant 10 minutes,

6- Puis laver environ 1 à 5 minutes à l'eau du robinet,

7- Déshydratation, nettoyer et monter sur un rack

Lésion du sarcome de Kaposi à coloration à l'hématoxyline-éosine - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Coloration de Papanicolaou

Ceci est également appelé coloration Pap ou frottis. Il est utilisé dans le but d'examiner des échantillons de cellules qui ont été obtenus à partir de fluides corporels.

La technique implique la combinaison de produits chimiques qui comprennent :

o Vert clair SF jaunâtre,

La solution différenciante ACCUMATE est prête à l'emploi. Un substitut de l'eau du robinet de Scott est préparé en mélangeant une partie du concentré de substitut d'eau du robinet de Scott avec 9 parties d'eau déminéralisée. Ceci est ensuite suivi par la filtration des réactifs du système de coloration papanicolaou avant utilisation.

1- Fixer les lames dans du fixateur acétique pendant 15 minutes,

2- Alcool absolu pendant deux minutes,

3- 70 pour cent d'alcool pendant 2 minutes,

4- à 50 pour cent pendant 2 minutes

5- Eau du robinet pendant 2 minutes,

6- en profondeur dans l'hématoxyline pendant 4 minutes,

7- Rincer brièvement à l'eau du robinet,

8- Différencier en alcool acide pendant environ 5 secondes,

10- Déshydrater à l'alcool absolu deux fois,

11- Colorer à l'orange G pendant dix secondes,

12- Rincer à l'alcool absolu deux fois

13- Colorer en E.A 50 pendant deux minutes,

14- Tache à l'alcool absolu deux fois,

15- Clair au xylène trois fois,

16- Monter la glissière sur du xylène trois fois,

une) Présence d'un corps de psammome en absence de cellules atypiques dans le frottis cervico-vaginal (coloration de Papanicolaou, 200×) b) Cystoadénofibrome ovarien séreux avec corps de psammome pariétaux (hématoxyline et éosine, 100×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Fuchsine acide et basique Tache

La fuchsine acide est un colorant acide rouge magenta largement utilisé pour la coloration du plasma, tandis que la fuchsine basique est un colorant basique magenta largement utilisé pour colorer le noyau.

La technique est également appelée coloration acido-résistante. Les bactéries acido-résistantes ont une substance cireuse (acide mycolique) sur leur paroi cellulaire qui les rend imperméables aux procédures de coloration.

Le terme acido-résistant est utilisé car ils résistent à la décoloration avec l'alcool acide. Carbol fuchsin, le colorant primaire contient du phénol, qui aide à solubiliser la paroi cellulaire tandis que la chaleur est utilisée pour augmenter la pénétration du colorant.

En utilisant de l'alcool pour décolorer, les cellules seront décolorées, à l'exception des cellules acido-résistantes. Le bleu de méthylène est utilisé comme contre-colorant pour toute cellule décolorée. À la fin de la procédure, les cellules acido-résistantes restent rouges/roses tandis que les cellules non acido-résistantes conservent une couleur bleue.

Préparation de carbol fuchsine en mélangeant deux solutions :

Solution 1- 0,2 gramme de fuchsine basique et 10 ml d'éthanol à 95 pour cent,

Solution 2- 5 grammes de phénol et 90 ml d'eau distillée,

1- Tamponner les larves de pulpe ensemble de manière à permettre à la pulpe de s'étaler sur la lame et laisser sécher

2- Fixer à la chaleur en flambant plusieurs fois sur un brûleur,

3- Inonder en utilisant 0,2 pour cent de carbol fuchsin pendant environ 30 secondes,

4- Laver la tache, puis sécher à l'air/éponger doucement avant l'examen

Une microphotographie de Mycobactérie smegmatis (rose) et Micrococcus luteus (bleu) Grossissement 1000x. Mycobactérie smegmatis est acido-résistant, conservant le colorant carbol fuchsine, apparaissant ainsi rose. Micrococcus luteus n'est pas acido-résistant, perd la fuchsine phéniquée lors de la décoloration et est contre-coloré au bleu de méthylène.

Image de : http://inst.bact.wisc.edu

La tache de Wright

Il s'agit d'un colorant métachromatique de type Romanowsky qui est préparé en mélangeant un colorant bleu de méthylène spécialement traité avec de l'éosine.

La partie acide de la tache s'unit aux composants de base des cellules tels que l'hémoglobine, et donc ils sont appelés éosinophiles et sont colorés en rose ou en rouge.

Les composants acides de la cellule, tels que les acides nucléiques, quant à eux, prennent le colorant basique et se colorent en bleu ou en violet.

Le pH doit être contrôlé à l'aide d'un tampon de 6,4 à 6,7 pour éviter une mauvaise coloration.

o Mesurez 1,0 gramme de poudre colorante Wright et 400 ml de méthanol (alcool méthylique),

o Ajoutez quelques billes de verre pour aider à la dissolution et ajoutez l'éthanol à la tache,

o Bien mélanger à intervalles jusqu'à ce que la poudre soit complètement dissoute (faire ceci en chauffant dans un bain-marie à 37 C pour faciliter la dissolution),

o Étiqueter les bouteilles et les marquer comme inflammables et toxiques,

o Bien recouvrir et conserver à température ambiante dans l'obscurité

1- Préparer un remplissage de l'échantillon et laisser sécher sur lame,

2- Préparez trois récipients, et remplissez-en un avec une étape de Wright's Stain et les deux autres avec de l'eau distillée,

3- Gardez la tache bien couverte lorsqu'elle n'est pas utilisée pour éviter l'évaporation (remplacez toujours la tache une fois qu'elle devient insuffisante)

4- Remplacez toujours l'eau distillée une fois qu'une écume irisée commence à se former à la surface, ou lorsqu'elle commence à virer au bleu,

5- Tremper la lame dans le colorant pendant 15 à 20 secondes,

6- Tremper la lame dans de l'eau distillée dans le deuxième récipient pendant 15-45 secondes,

7- Tremper la lame dans le récipient 3 pendant 25 secondes en utilisant des trempettes rapides,

8- Essuyez le dos de la glissière,

9- Sécher la lame en position verticale, sur la surface absorbante et éviter d'éponger le frottis,

10- Appliquer de l'huile pour examiner au microscope,

Ces étapes doivent être répétées deux fois pour les frottis de moelle.

1- Préparer l'échantillon et laisser sécher à l'air,

2- Placer la lame sur une grille,

3- Appliquer la teinture de wright en une étape à l'aide de flacons compte-gouttes,

4- Attendez environ 15-30 secondes et ajoutez des volumes similaires d'eau distillée,

5- Verser le mélange de teinture et d'eau hors de la lame,

6- Tremper la lame dans de l'eau distillée pendant environ 25 secondes en utilisant des trempettes rapides,

7- Essuyez l'arrière de la glissière,

8- Sécher la lame en position verticale côté absorbant et éviter de tacher le frottis,

Ces étapes doivent être répétées deux fois pour les échantillons de moelle osseuse.

Image de : http://www.vetmed.vt.edu

Coloration de Gram

C'est l'une des techniques de coloration les plus courantes.

Il est largement utilisé pour différencier les espèces de bactéries en gram positif ou gram négatif. Ceci est obtenu grâce aux propriétés chimiques des parois cellulaires bactériennes, où différentes couleurs sont affichées après coloration.

Cette technique est basée sur le fait que la paroi cellulaire à Gram positif a une forte attraction pour le cristal violet suite à l'ajout d'iode par rapport à la paroi cellulaire à Gram négatif.

L'iode est le mordant et forme un complexe avec le cristal violet, qui est facilement éliminé de la paroi cellulaire à Gram négatif à l'aide d'alcool éthylique.

Coloration cellulaire en microscopie est utile et nécessaire pour mettre en évidence les éléments structurels de votre échantillon/spécimen à observer correctement. Il y en a d'autres que MicroscopeMaster peut couvrir à l'avenir, alors ajoutez cette page à vos favoris et revisitez-la pour voir plus d'informations sur la coloration.

En savoir plus sur la culture cellulaire, la division cellulaire, la différenciation cellulaire ainsi que les types et techniques de culture tissulaire. Et jetez un œil aux raisons d'envisager l'achat d'un kit de coloration pour microscope.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Technique Pathologique. Philadelphie et Londres. W.B. Société Sunders. Copyright, 1938, par W.B. Société Sunders. Réimprimé en juin 1942 et septembre 1944. Pgs. 70 et 9

Johnson PL, Klein MN : Application du colorant de Papanicolaou sur des coupes en paraffine. Technologie de teinture 31:223, 1956

Delisle, G. et L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, Société américaine de microbiologie, Washington, DC.

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Sous-culture de cellules en suspension

Les protocoles suivants décrivent procédures générales de sous-culture de cellules de mammifères en culture en suspension. Notez que la procédure de passage des cellules d'insectes diffère de celle des cellules de mammifères sur plusieurs étapes cruciales. Pour plus d'informations, reportez-vous à Notes sur la sous-culture de cellules d'insectes.

Pour transmettre votre propre lignée cellulaire, nous vous recommandons de suivre attentivement les instructions fournies avec chaque produit que vous utilisez dans vos expériences. Les conséquences de s'écarter des conditions de culture requises pour un type cellulaire particulier peuvent aller de l'expression de phénotypes aberrants à un échec complet de la culture cellulaire.

Cultures en suspension de passage
La sous-culture de cellules en suspension est un peu moins compliquée que le passage de cellules adhérentes. Parce que les cellules sont déjà en suspension dans le milieu de croissance, il n'est pas nécessaire de les traiter par voie enzymatique pour les détacher de la surface du récipient de culture, et l'ensemble du processus est plus rapide et moins traumatisant pour les cellules. Le remplacement du milieu de croissance n'est pas effectué dans les cultures en suspension au contraire, les cellules sont maintenues en les nourrissant tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence. Cela peut être fait en diluant directement les cellules dans le flacon de culture et en continuant à les étendre, ou en retirant une partie des cellules du flacon de culture et en diluant les cellules restantes jusqu'à une densité d'ensemencement appropriée pour la lignée cellulaire. Habituellement, la période de latence suivant le passage est plus courte que celle observée avec les cultures adhérentes.


Désagrégation des tissus

Hacher les tissus

Après dissection des tissus solides d'un organisme, avant d'introduire les enzymes digestives, les tissus doivent être rincés pour éliminer tout sang ou autre matière indésirable. Les tissus doivent ensuite être hachés et dispersés avec des ciseaux, un scalpel ou une lame pour augmenter la surface totale. Cela augmente le contact entre les enzymes et la surface des tissus, conduisant à une digestion plus efficace et plus complète tout en raccourcissant le temps nécessaire à la digestion.

Enzymes

Les tissus maintiennent les cellules ensemble, soutenus par une matrice extracellulaire et des jonctions cellule-cellule composées d'un ensemble diversifié de protéines et d'autres molécules biologiques qui nécessitent des enzymes spécifiques pour une digestion et une élimination correctes de la suspension cellulaire. Les enzymes digestives qui jouent un rôle essentiel dans la désagrégation des tissus solides sont résumées dans le tableau 1. La première catégorie d'enzymes à considérer est celle des enzymes qui décomposent la matrice extracellulaire. Dispase est une protéase neutre couramment utilisée isolée de bactéries, avec un niveau élevé de spécificité enzymatique pour le collagène IV et la fibronectine 21, 22. Dispase est utile dans le détachement des colonies cellulaires et la dissociation des morceaux de tissu en petits amas de cellules, car il agit pour cliver les attaches entre les cellules et la matrice extracellulaire sans affecter les jonctions cellule-cellule 23 . Des précautions doivent être prises lors de la digestion des tissus avec dispase, cependant, car il est capable de cliver des molécules de surface ou des antigènes pertinents spécifiques, tels que ceux liés à l'analyse des cellules T 24, 25. Par conséquent, l'omission de la dispase du tampon de digestion peut être utile si une perte d'épitopes est observée. La collagénase est également efficace dans la désagrégation de la matrice extracellulaire. La collagénase est capable de briser les liaisons peptidiques présentes dans le collagène, ce qui aide à digérer la matrice extracellulaire, libérant les cellules en suspension. Il est important de noter que les enzymes de la collagénase purifiée sont plus efficaces que la collagénase traditionnelle naturellement dérivée des bactéries car il y a moins de variabilité dans la composition de l'enzyme purifiée, augmentant la stabilité des cellules tout au long de la digestion des tissus 26 . La dernière enzyme à considérer dans la digestion de la matrice extracellulaire dans les tissus solides est la hyaluronidase. L'hyaluronane, un protéoglycane structurel dans la matrice extracellulaire, est dégradé par la famille d'enzymes hyaluronidase, qui sont produites dans les organismes bactériens et vertébrés. Ces enzymes hyaluronidases clivent la liaison β1,4-glycosidique présente dans la partie glycosaminoglycane du hyaluronane 27, contribuant à la digestion de la matrice extracellulaire.

-Décompose la matrice extracellulaire

-Clive les attaches entre les cellules et la matrice extracellulaire

-Décompose la matrice extracellulaire

-Brise les liaisons peptidiques présentes dans le collagène

-Décompose la matrice extracellulaire

-Clive les liaisons glycosidiques dans l'hyaluronane

-Empêche l'agrégation des cellules

-Clive les jonctions cellule-cellule

-Ne modifie pas l'expression de l'antigène comme le ferait la trypsine

Le prochain groupe d'enzymes à prendre en compte dans la préparation d'une suspension cellulaire unique comprend les enzymes qui rompent les jonctions cellule-cellule. La trypsine est une protéase naturelle synthétisée dans le système digestif des organismes vertébrés. Bien qu'elle soit utile pour dégrader certaines protéines présentes dans les jonctions cellule-cellule, la trypsine a également un effet très sévère sur les protéines de la membrane cellulaire 1 . En outre, il a été démontré que la trypsine conduit à l'agrégation des cellules induite par l'ADN libre, ce qui indique que la lyse cellulaire se produit dans la suspension 28 . Par conséquent, la trypsine est traditionnellement évitée dans la préparation d'une suspension cellulaire unique à partir de tissus solides pour des expériences de cytométrie en flux. La papaïne est une protéase alternative dérivée de la papaye. La papaïne est connue pour dégrader les protéines qui constituent les jonctions serrées entre les cellules 29 . Cependant, comme la trypsine, il a été démontré que la papaïne entraîne une agrégation cellulaire induite par l'ADN libre en raison de la lyse cellulaire qui se produit pendant la digestion enzymatique 28 .

Le dernier type d'enzyme à considérer dans la préparation d'une suspension cellulaire unique est la désoxyribonucléase (DNase) qui agit pour cliver les liaisons phosphodiester du squelette de l'ADN. Les deux principaux types de DNase sont la DNase-I et la DNase-II, qui possèdent des fonctions enzymatiques légèrement différentes. La DNase-II ne convient pas à la préparation d'une suspension cellulaire unique car elle joue un rôle dans les voies de dégradation de l'ADN induites par l'engloutissement impliquées dans l'apoptose 30, 31. La DNase-I est appropriée pour la digestion des tissus et la préparation d'une suspension cellulaire unique car elle empêche l'agrégation cellulaire en dégradant l'ADN libre libéré par la lyse des cellules mortes pendant la digestion enzymatique sans initier les voies apoptotiques. Chlorure de calcium (CaCl2) agit comme un activateur enzymatique de la DNase-I et est donc introduit dans le cocktail de digestion lors de la digestion enzymatique. Les ions calcium (Ca 2+ ) se lient étroitement à l'enzyme DNase-I pour stabiliser sa conformation active et permettre la dégradation appropriée de l'ADN libre 32 .

Pour éviter les problèmes possibles causés par l'ajout des enzymes ci-dessus à un cocktail de digestion tissulaire, des cocktails de digestion disponibles dans le commerce ont été développés et optimisés. Accutase est un mélange de protéase et de collagénase disponible dans le commerce qui imite l'action de la trypsine et de la collagénase mais le fait à une concentration beaucoup plus faible que celle nécessaire lors de l'utilisation des enzymes standard. Accutase contient un mélange d'enzymes à activité protéolytique, collagénolytique et DNase et produit un rendement cellulaire total plus élevé et une préservation globale améliorée de l'antigène par rapport à l'utilisation d'un cocktail d'enzymes similaires pour la digestion des tissus 33, 34. TrypLE est un autre cocktail enzymatique disponible dans le commerce contenant des enzymes recombinantes purifiées qui imitent l'activité de la trypsine sans altérer l'expression des antigènes de surface cellulaire 35 . Ce produit évite les problèmes liés à l'utilisation de la trypsine dans la digestion des tissus et permet une survie cellulaire améliorée et une préparation plus efficace de la suspension unicellulaire.

Dissociation enzymatique et mécanique

La dissociation enzymatique est réalisée en introduisant un cocktail de digestion dans des tissus solides hachés et en incubant à des températures spécifiques, en fonction du cocktail enzymatique utilisé. Les enzymes peuvent être spécifiques à la température et donc fonctionner avec une vitesse et une efficacité maximales à une température donnée, généralement 37°C. Selon les enzymes spécifiques, la dissociation enzymatique peut également être effectuée à 4°C ou sur de la glace. Ces températures plus basses ralentiront probablement la vitesse de réaction des enzymes et prolongeront la période d'incubation, mais peuvent aider à minimiser la mort cellulaire. La force de l'enzyme et la concentration de l'enzyme sont les deux facteurs les plus importants à considérer lors du choix d'un cocktail de digestion pour la préparation d'une suspension cellulaire unique pour la cytométrie en flux. Les enzymes à forte concentration ou à haute concentration peuvent compromettre les marqueurs de surface cellulaire présents sur les cellules, ce qui peut affecter la disponibilité de ces marqueurs et la viabilité des cellules dans d'autres expériences. Par conséquent, les cellules légèrement adhérentes telles que les lymphocytes doivent être isolées en utilisant une courte période de digestion avec une enzyme douce ou douce pour éviter ces problèmes 36 . La détermination de la force et de la concentration optimales des enzymes utilisées dans la dissociation enzymatique est empirique et critique pour un isolement correct des cellules et une digestion réussie des tissus.

La dissociation mécanique joue un rôle dans la préparation d'une suspension cellulaire unique à partir de tissus solides tout au long de la dissociation enzymatique. Pour aider à la dissociation mécanique des tissus, par laquelle les cellules sont libérées de la matrice extracellulaire en suspension, la digestion enzymatique peut être effectuée sur un agitateur orbital. Après la dissociation enzymatique, la suspension doit être filtrée afin d'exclure tout morceau de tissu ou agrégat non digéré de la suspension unicellulaire nouvellement préparée.


16 : Tache simple

Afin de colorer l'échantillon bactérien pour la microscopie, il faut d'abord préparer le frottis sur la lame. Cela implique essentiellement trois étapes ---- transférer une suspension liquide de la bactérie sur la lame, sécher le frottis, puis chauffer légèrement pour attacher fermement le frottis à la lame. Une fois cela fait, la procédure de coloration commence.

Ne rendez PAS vos suspensions de frottis trop épaisses. Le colorant ne pénétrera pas bien et il y aura beaucoup trop de cellules bactériennes pour voir les formes et les arrangements individuels. Il faut faire attention aux frottis épais lors du prélèvement de l'échantillon dans un milieu gélosé.

RECOMMANDATION: Vous trouverez peut-être utile de dessiner un cercle (un crayon de cire est préférable) sur le côté opposé de la lame où vous étalerez votre frottis. Cela vous aidera plus tard à localiser le frottis, parfois un problème lors du déplacement de la lame d'avant en arrière à la recherche de vos bactéries. Le crayon de cire est meilleur qu'un marqueur car il ne se lavera pas facilement du verre.


Procédure

    Obtenir une suspension uniforme de cellules: Suivez le protocole de typsinisation/neutralisation de la trypsine pour le type de cellule spécifique. Placer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de taille appropriée. Pour obtenir une numération cellulaire précise, une suspension uniforme contenant des cellules individuelles est nécessaire. Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas dans le tube 5 à 7 fois à l'aide d'une pipette à petit alésage (pipette de 5 ml ou 10 ml). Pour les cellules décongelées par cryoconservation (dans 1 ml de milieu de cryoconservation), pipeter de haut en bas 7 à 10 fois à l'aide d'une pipette de 1 ml.

Pour une détermination précise, le nombre total de cellules recouvrant un 1 mm 2 doit être compris entre 15 et 50. Si le nombre de cellules par 1 mm 2 dépasse 50, diluer l'échantillon et compter à nouveau. Si le nombre de cellules par 1 mm 2 est inférieur à 15, utilisez un échantillon moins dilué. Si des échantillons moins dilués ne sont pas disponibles, compter les cellules des deux côtés de l'hémocytomètre (zones de 8 x 1 mm 2 ).

Gardez un compte séparé des cellules viables et non viables. Si plus de 25 % des cellules ne sont pas viables, la culture n'est pas maintenue sur la quantité appropriée de milieu. Réincuber la culture et ajuster le volume des milieux en fonction de la confluence des cellules et de l'aspect des milieux. Incluez les cellules en haut et à gauche touchant la ligne médiane. Les cellules touchant la ligne médiane en bas et à droite ne sont pas comptées.

je. Le bleu Trypan est le « colorant vital » exclu des cellules vivantes.
ii. Les cellules vivantes apparaissent incolores et brillantes (réfractiles) sous contraste de phase.
iii. Les cellules mortes se colorent en bleu et ne sont pas réfringentes.

  • % Viabilité des cellules = [Total des cellules viables (non colorées) / Total des cellules (viables + mortes)] X 100.
  • Cellules viables/ml = nombre moyen de cellules viables par carré x facteur de dilution x 10 4 /
  • Nombre moyen de cellules viables par carré = Nombre total de cellules viables dans 4 carrés / 4.
  • Facteur de dilution = Volume total (Volume d'échantillon + Volume de liquide de dilution) / Volume d'échantillon.
  • Cellules viables totales/échantillon = Cellules viables/ml x Le volume original de fluide à partir duquel l'échantillon de cellules a été prélevé.
  • Volume de milieu nécessaire = (Nombre de cellules nécessaires/Nombre total de cellules viables) x 1000.

Conclusion

Le protocole d'isolement HTF présenté ici est une méthode simple et rapide pour obtenir un grand nombre de cellules (1,3 × 10 6 fibroblastes positifs à la vimentine) à partir d'une seule biopsie de trabéculectomie de 2 à 3 mm × 1 mm dans un délai d'environ. 25 jours. Notre protocole peut permettre une configuration facile des banques de cellules dans des conditions de laboratoire et pour de nouveaux tests de médicaments ophtalmologiques in vitro. Il a également été démontré que 5 % de FGF-EMEM est un meilleur choix que 10 % de DMEM pour une propagation rapide des HTF avant la préparation des expériences. Cependant, dans le cas des études visant à évaluer l'effet d'un agent testé sur le taux de prolifération ou la capacité de production de collagène de type I, 5% de FGF-EMEM doivent être utilisés uniquement pour l'isolement des HTF, puis 10% de DMEM doivent être appliqués pour configuration expérimentale, car 5% de FGF-EMEM affecte de manière significative les divisions cellulaires et la capacité de formation d'ECM des fibroblastes.


Protocoles de préparation des échantillons

La microscopie confocale devenait plus qu'une simple nouveauté au début des années 1980 en raison de l'essor des applications de la fluorescence à grand champ pour étudier l'architecture et la fonction cellulaires. Alors que les techniques d'immunofluorescence, ainsi que la coloration des structures subcellulaires à l'aide de fluorophores synthétiques, sont devenues largement pratiquées à la fin des années 1970, les microscopistes sont devenus de plus en plus frustrés par leur incapacité à distinguer ou à enregistrer les détails fins dans les instruments à grand champ en raison de l'interférence par l'émission de fluorescence se produisant au-dessus et au-dessous le plan focal. Aujourd'hui, la microscopie confocale, lorsqu'elle est couplée à l'application de nouveaux fluorophores synthétiques avancés, de protéines fluorescentes et de réactifs d'immunofluorescence, est l'une des méthodes les plus sophistiquées disponibles pour sonder la structure sous-cellulaire. Les protocoles décrits dans cette section traitent des techniques de préparation des échantillons à l'aide de fluorophores synthétiques couplés à l'immunofluorescence qui sont nécessaires pour enquêter sur les cellules adhérentes fixes et les cryosections tissulaires à l'aide de la microscopie à fluorescence à grand champ et confocale.

Deux jours après l'induction du tamoxifène, les cellules épithéliales de la fosse interpapillaire expriment des couleurs aléatoires, indiquant que plusieurs clones ont proliféré indépendamment. Cependant, après 84 jours, chaque fosse interpapillaire était occupée par des cellules d'une seule couleur, indiquant qu'elles sont dérivées de cellules souches monoclonales. (Nature Cell Biology 15, 511-518, 2013)

Données d'image avec l'aimable autorisation de :
Hiroo Ueno(Ph.D.)
Département de pathologie des cellules souches, Université médicale du Kansai

La figure 1 présente une image confocale à balayage laser révélant le vaste réseau d'actine filamenteuse présent dans le tissu musculaire lisse d'une cryosection mince (8 micromètres) de diaphragme de rat. La cryosection tissulaire a été marquée avec un cocktail contenant de l'Alexa Fluor 488 conjugué à de la phalloïdine (coloration de l'actine) et du Texas Red-X conjugué à de l'agglutinine de germe de blé (ciblant les lectines). De plus, les noyaux de l'échantillon ont été contre-colorés avec Hoechst 33342. Les images ont été enregistrées en niveaux de gris avec un Olympus FluoView FV1000 couplé à un microscope inversé IX81 utilisant Argon-ion (ligne de 488 nanomètres), diode violette (405 nanomètres) et hélium vert- lasers au néon (543 nanomètres). Au cours de l'étape de traitement, les canaux d'image individuels ont été pseudocolorés avec des valeurs RVB correspondant à chacun des profils spectraux d'émission de fluorophore.

Protocoles de coloration

Cellules adhérentes à triple coloration avec MitoTracker, Phalloïdine (ou Phallacidine) et colorants nucléaires

La vitalité et les propriétés physiques des cellules adhérentes cultivées sur des lamelles dans des boîtes de Pétri peuvent être déterminées à l'aide d'une combinaison de colorants fluorescents. Ce protocole détaille une procédure généralisée pour la coloration d'une variété de types de cellules.

Coloration des cellules adhérentes avec des anticorps primaires à filament intermédiaire et des fluorophores synthétiques

Les lignées cellulaires de fibroblastes et épithéliales dérivées d'humains et d'animaux de laboratoire produisent des échantillons fluorescents aux couleurs vives mettant en évidence des protéines spécifiques dans le réseau de filaments intermédiaires lorsqu'elles sont colorées.

Coloration des cellules et des cryosections tissulaires avec des anticorps primaires de tubuline, des phallotoxines et des fluorophores synthétiques

Des lignées cellulaires et des coupes de tissus de mammifères provenant d'humains et d'animaux de laboratoire, y compris l'intestin, les reins, les testicules, les muscles, le foie et les poumons, produisent des échantillons fluorescents aux couleurs vives.

Coloration des cellules adhérentes avec des anticorps primaires contre la cytokératine et des fluorophores synthétiques

Les lignées cellulaires épithéliales dérivées d'humains et d'animaux de laboratoire produisent des échantillons fluorescents aux couleurs vives détaillant le réseau de filaments intermédiaires de cytokératine lorsqu'ils sont colorés avec des anticorps à la kératine.

Cryosections tissulaires à triple coloration avec agglutinine de germe de blé, phalloidine et colorants nucléaires

La majorité des coupes de tissus communs dérivées d'animaux de laboratoire, y compris l'intestin, les reins, les testicules, les muscles, le foie et les poumons, produisent des spécimens fluorescents aux couleurs vives détaillant une grande variété de caractéristiques anatomiques lorsqu'ils sont colorés.

Immunofluorescence avec cryosections de tissus cérébraux

Parmi les cibles d'anticorps souvent marquées dans les coupes de tissu cérébral figurent la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), neurofilaments neuronaux et axonaux, classe III bêta-tubuline, protéines associées aux microtubules, protéines de la barrière hémato-encéphalique et antigènes associés à des maladies spécifiques.

Immunofluorescence avec cryosections flottantes de tissu cérébral

L'immunofluorescence indirecte est une technique qui permet la visualisation de cibles spécifiques en utilisant une combinaison d'anticorps primaires et secondaires. Ce protocole détaille une procédure de coloration des cryosections flottantes du cerveau congelé supérieures à 30 micromètres d'épaisseur.

Auteurs contributeurs

Nathan S. Claxton, Gregory K. Ottenberg, John D. Griffin, Scott G. Olenych, et Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Floride, 32310.


Protocole de cytométrie en flux : coloration des marqueurs de surface cellulaire

Noter: Cette méthode convient à la coloration de la surface cellulaire en cytométrie de flux.

Les marqueurs de surface cellulaire sont exprimés à la surface cellulaire et peuvent être utilisés pour définir des sous-types cellulaires ainsi que leur fonction lorsqu'ils sont marqués avec des anticorps marqués par fluorescence et analysés par cytométrie en flux. Comme ces protéines de surface sont accessibles aux anticorps, elles peuvent être facilement colorées sans étapes de perméabilisation qui sont essentielles à la coloration intracellulaire.

  • PBS: Dissoudre 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HPO4 et 0,2 g de KH2Bon de commande4 in 800 mL distilled water. Adjust the pH to 7.4 with HCl and final volume to 1 liter with additional distilled H2O.
  • Cell staining buffer: Add 0.5% BSA and 0.05% Sodium Azide (NaN3) to PBS.
  • Fc receptor binding reagents
  • Conjugated primary antibodies
  • Conjugated secondary antibodies, if needed

Sample preparation:

1. Harvest the desired tissues and cells, prepare a single cell suspension and adjust the suspension to a concentration of 1 x 10 6 cells/mL in cell straining buffer.

Blocking Fc-receptors (optional):

2. Blocking Fc receptors is useful to reduce non-specific immunofluorescent staining. Add 1 μg of Fc receptors binding reagents per 1 x 10 6 cells and incubate for 10 minutes at room temperature.

  • For mouse cells, purified anti-mouse CD16/CD32 antibody specific for Fcγ R III/II (cat. no. CABT-45660RM) can be used to block the Fc receptors.
  • For human cells, purified human Fc receptor binding inhibitor solution can be used to eliminate non-specific staining.
  • In the absence of an effective/available blocking antibody for Fc receptors, an alternative approach is to block cells with excess irrelevant purified IgG from the same species and same isotype as the antibodies used for immunofluorescent staining.

Noter: Do not wash excess blocking reagents from this reaction.

3. Add appropriately primary antibody with previously determined optimum concentration and vortex. Incubate on ice for 15 to 30 minutes.

Noter: If using primary antibodies directly conjugated with fluorochrome, the incubation should be carried out in the dark, and then skip to Step 7.

4. Wash cells with cell staining buffer to remove any unbound antibodies. Centrifuge at 300-400 x g for 5 minutes at 4°C and discard supernatant.

6. Add an appropriate fluorescent-conjugated secondary antibody with recommended concentration. Incubate on ice for 15-20 min in the dark.

7. Repeat Step 4 three times.

8. Resuspend cell in 200-500 uL cell staining buffer for final flow cytometric analysis.


Immunofluorescence protocol (IF protocol)

Immunofluorescence is one of the widely used techniques in modern biology and medicine, and it is developed by Coons et al. (1950), and it is a combination of immunofluorescence technique and morphological technology to develop immune fluorescent cells (or tissue). The development of fluorescence immunoassay technology is very fast in recent years, especially in the field of medical, biological and environmental studies, it is widely used in the determination of endocrine hormones, growth factors, proteins, nucleic acids, neurotransmitters, receptors, in vivo drug and infectious sources, and so on, these subjects have been developed. According to the detection of different samples can be divided into three major categories.
There are two different immunofluorescence assay which include indirect immunofluorescence assay and direct immunofluorescence assay.For indirect immunofluorescence assay, the protocol mainly include tissue or cell preparation, tissue or cell fixation, serum blocking, primary antibody incubation, marked second antibody incubation, staining, result judgment and imaging. For direct immunofluorescence assay, there are only marked primary antibody been incubated without second antibody and other steps are same.
For direct immunofluorescence assay, specific fluorescent antibody was prepared by the combination of specific antibodies and fluorescein. It is the most simple and fast method for the examination of cell or tissue antigen. This method is highly specific and is commonly used in renal biopsy and pathogen examination. Its disadvantage is that a fluorescent antibody can only examine one kind of antigen, which is less sensitive. For indirect immunofluorescence assay, specific antibodies against the corresponding antigen, fluorescein labeled anti - antibody (anti - specific IgG fluorescent antibody) and the primary antibody
Although the basic steps and principles of immune fluorescence are the same, but because of the specific conditions are not the same, the detailed operation steps of each laboratory will not be exactly the same. For example, the use of the solution, the fixed liquid and antibody dilution liquid will be slightly different. Here to give a more common method, the detailed use of the operation can be based on the steps to adjust and change, and ultimately determine the most appropriate method for youself.

Indirect Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each
11. Incubate samplels with fluorochrome-conjugated secondary antibody at appropriate dilution in PBS for 1 hour at 37°C in dark(optimal condition should be confirmed in different l aboratory)
12. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
13. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
14. Mount samples with a drop of mounting medium

Direct Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with fluorochrome- conjugated primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
11. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
12. Mount samples with a drop of mounting medium