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Les constructions Yeast Insertion reviennent-elles?


Si j'insère un nouveau gène avec un plasmide d'intégration de levure et sélectionne une fois avec une culture d'abandon, puis-je supposer que le gène nouvellement intégré restera dans la souche sans exercer de pression sélective dessus ? (c'est-à-dire que puis-je utiliser une culture liquide normale et des plaques après avoir obtenu la levure avec la souche nouvellement intégrée ?


Cela dépend exactement de ce que vous avez fait.

La manière standard d'utiliser un plasmide d'intégration de levure (YIp) est qu'il s'intègre dans le génome par recombinaison entre un morceau d'ADN de levure que porte le YIp et le même ADN dans le génome. C'est souvent, mais pas nécessairement, le marqueur sélectionnable. Ainsi par exemple un YIp portant le URA3 gène car son seul ADN de levure s'intégrera au URA3 locus (probablement mutant pour permettre la sélection pour Ura+, donc plus correctement ura3).

Si le YIp est linéarisé en coupant sur un site dans le URA3 marqueur, cela dirigera l'insertion et augmentera l'efficacité de la transformation.

Une fois l'insertion effectuée, la configuration sur le site d'intégration est :

chromosome… URA3… autres séquences YIp… ura3… chromosome

Ceci est intrinsèquement instable car un événement de bouclage peut avoir lieu passant par recombinaison entre les URA3/ura3 Régions. Supprimer la sélection signifie donc que vous courez le risque de perdre l'insert. De plus, il est possible qu'un bouclage se produise en laissant le URA3 allèle derrière au lieu du ura3 allèle. Vous pouvez donc perdre le vecteur même lorsque la sélection est maintenue (mais cela dépendra de la nature exacte de la mutation).

Des configurations plus complexes sont possibles lorsque la séquence de ciblage est distincte du marqueur sélectionnable, et où la digestion supprime un morceau entier de la séquence de ciblage avant la transformation. Ainsi par exemple si le TRP1 gène a été utilisé pour cibler un plasmide avec le URA3 marqueur dans un TRP1 ura3 souche que vous obtiendriez :

chromosome… TRP1 fragment A… URA3+autres séquences YIp… TRP1 fragment B… chromosome

le transformant résultant est maintenant Ura+ en raison de l'intégration URA3 plasmide, mais certains TRP1 L'ADN est maintenant manquant (l'ADN qui a été excisé lorsque le plasmide a été digéré) donc la souche est trp1. L'apparition de ce Trp- le phénotype indique que la transformation s'est probablement produite par la voie décrite.

Dans ce cas, le plasmide inséré est beaucoup plus stable car ces deux fragments restants de TRP1 L'ADN n'est pas identique, il n'y a donc aucune possibilité de boucle.

En résumé, si votre transformant a l'insert portant le "nouveau gène" flanqué d'une séquence répétitive, alors il est instable, sinon vous pouvez supprimer la sélection. Dans le premier cas, si le nouveau gène est délétère alors il y aura une forte pression sélective en faveur des cellules qui ont perdu l'insert.

Addenda

Vous pouvez éviter complètement d'utiliser des plasmides YIp en intégrant votre nouveau gène à n'importe quel locus à l'aide d'amorces de ciblage longues, comme le montre la figure ci-dessous.

Concevez des amorces pour amplifier votre gène comme d'habitude, mais synthétisez-les avec des extensions 5' de 40 pb correspondant à deux séquences aux extrémités du site d'intégration (URA3 utilisé ici à des fins d'illustration). Le fragment résultant peut ensuite être utilisé dans une transformation et s'intégrera au URA3 site par recombinaison homologue, remplaçant l'ADN résident. L'avantage d'utiliser URA3 car c'est que vous pouvez sélectionner pour les intégrants comme Ura- cellules par résistance à l'acide fluoorotique (FOA). Bien que vous puissiez probablement sélectionner directement pour cela, j'ai toujours co-transformé le fragment avec un autre plasmide sélectionnable (LEU2, TRP1 etc., mais pas un plasmide CEN) Ensuite, votre p. Leu+ les transformants peuvent être criblés pour ceux qui sont également devenus FOAR. Cette co-transformation se produit à une fréquence assez élevée parce que les cellules qui absorbent l'ADN en absorbent une grande partie. Une fois que vous avez supprimé la sélection pour le plasmide co-transformant, il sera bientôt perdu, vous laissant avec un intégrant non réversible propre.

Cela fait un moment que je n'ai pas fait ce genre de chose - il existe probablement des méthodes encore plus intelligentes maintenant.


Les plasmides d'intégration de levure sont connus pour être stables, même en l'absence d'un milieu sélectif, mais peuvent régresser comme la plupart des plasmides de recombinaison homologue.

Citation du livre Analyse des gènes de levure (pg476):

Les YIps sont généralement plus stables que les plasmides YRp ou YEp. En conséquence, il est sûr de cultiver la plupart des souches porteuses de YIp dans un milieu riche, bien qu'il soit de bonne pratique de les stocker dans des conditions sélectives. La stabilité des souches portant YIp dépend de la nature de l'événement d'intégration. Par exemple, si le YIp génère une répétition en tandem lors de l'intégration dans le génome, cela peut revenir au type sauvage par un événement de recombinaison homologue intramoléculaire.

-> donc utilisez des marqueurs régulièrement et fréquemment.

Sources:

Mick F. Tuite, Yeast Gene Analysis Vol 26 (Academic Press, 1998) p.476


Une amorce d'interactome ABC de levure

L'analyse de l'interactome du transporteur de cassettes de liaison à l'ATP de levure fournit des informations pertinentes pour la santé humaine sur la régulation et la fonction d'une famille de protéines qui détermine la tolérance aux conditions physiologiques et au stress imposé de l'extérieur.

La plupart des études sur l'interactome de la protéine de levure ont utilisé soit le système à deux hybrides de levure (YTH) pour identifier les couplages appâts-proies intranucléaires solubles, soit la MS pour identifier les composants de co-complexes solubles marqués par affinité (AP-MS) 3 . Pour les protéines membranaires, MS de co-complexes stables, purifiés par affinité et solubles dans les détergents a été utilisé 8 . Les trois approches détectent les interactions fonctionnelles et réglementaires qui peuvent être annotées par « culpabilité par association ». Cependant, des limitations importantes existent dans l'obtention de résultats de qualité au niveau du système et l'identification des réseaux avec différentes propriétés topologiques et biologiques dépend de la méthode 9 . Le système de levure membranaire à deux hybrides (MYTH) utilise la reconstitution d'une ubiquitine divisée pour rendre compte des interactions entre les protéines membranaires présentées comme des appâts et leurs proies in situ dix . La reconstitution d'une ubiquitine quasi native active les gènes qui permettent la croissance sur un milieu sélectif est vérifiée à l'aide d'un rapporteur lacZ, tandis que la localisation de l'appât attendue est confirmée à l'aide d'un YFP attaché à l'appât (iMYTH) 3,10. Snider et al. 7 utilisent une analyse phénotypique pour évaluer l'impact de certaines constructions d'appâts de transporteur ABC de levure sur la fonction cellulaire et un domaine C-terminal d'ubiquitine muté qui nécessite un complexe appât-proie pour la reconstitution de l'ubiquitine. La complémentation fluorescente bimoléculaire à l'aide d'un YFP divisé confirme les interactions appât-proie et identifie la localisation subcellulaire du co-complexe appât-proie.


INTRODUCTION

La translocation des protéines à travers et l'intégration dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sont toutes deux médiées par le complexe translocon Sec61 (Johnson et van Waes, 1999). Les protéines sont ciblées sur ce complexe par des séquences signal hydrophobes (von Heijne, 1990). Les signaux non clivés et les segments hydrophobes ultérieurs du polypeptide sont intégrés dans la bicouche sous forme d'hélices transmembranaires. Ni les déterminants de la topologie des protéines dans la membrane ni le mécanisme d'intégration ne sont entièrement compris. Le cas le plus simple de la topogenèse des protéines dans la membrane est l'orientation de la séquence signal lors de l'entrée dans le translocon. Les séquences de signaux peuvent déplacer soit l'extrémité C-terminale (signaux clivables et ancres de signal) soit l'extrémité N-terminale (ancres de signal inversées). Le déterminant le mieux établi de l'orientation du signal est la distribution des résidus chargés de chaque côté du noyau hydrophobe du signal. Selon la « règle positive à l'intérieur » (von Heijne, 1986 Hartmann et al., 1989), l'extrémité la plus positive est généralement cytosolique. Des déterminants supplémentaires sont le repliement des séquences N-terminales vers un signal interne qui peut entraver stériquement la N-translocation (Denzer et al., 1995), et l'hydrophobie du noyau de signal apolaire (Sakaguchi et al., 1992 Wahlberg et Spiess, 1997 Eusebio et al., 1998 Harley et al., 1998 Rösch et al., 2000 Goder et Spiess, 2003).

Le translocon Sec61 se compose de Sec61α (Sec61p chez la levure) avec 10 domaines transmembranaires, et des protéines couvrantes simples Sec61β (Sbh1p) et Sec61γ (Sss1p), correspondant chez les bactéries au complexe SecY (SecY/SecG/SecE). La structure cristalline récente du complexe archéobactérien SecY de Methanococcus jannaschii (Van den Berg et al., 2004) a révélé un faisceau d'hélices étonnamment compact avec un pore de canal hydrophile potentiel et un site de sortie latéral constitué de segments transmembranaires TM2 et TM7, cohérent avec les données de réticulation précédentes (Plath et al., 1998). Cela suggère que le canal de translocation est formé par un seul hétérotrimère. La structure représente clairement l'état fermé, car le passage central est bloqué par un domaine bouchon luminal et un anneau de constriction central. Pour s'ouvrir, le bouchon doit sortir et la bague doit se dilater pour élargir le passage central. Par mutagenèse de la cystéine et réticulation disulfure, il a été démontré que les polypeptides en translocation se localisent effectivement au centre de SecY dans Escherichia coli (Canon et al., 2005). Le domaine bouchon est susceptible d'être impliqué dans le déclenchement du translocon déclenché par la séquence signal pour permettre l'entrée et le transfert du polypeptide à transloquer et pour sceller le canal lorsqu'il est inactif (Tam et al., 2005).

Dans une analyse systématique des résidus chargés conservés dans Sec61p qui étaient candidats pour être responsables de la règle positive à l'intérieur, trois résidus, R67, R74 et E382, ont été identifiés pour remplir les critères d'augmentation de la N-translocation d'un modèle d'ancre de signal. protéine avec des charges flanquantes N-terminales plus positives lorsqu'elles sont mutées et pour diminuer la N-translocation d'une protéine modèle avec une différence de charge opposée (Goder et al., 2004). Sur la base de la structure du complexe archéobactérien SecY, E382 est situé à l'extrémité cytoplasmique du segment transmembranaire TM8, et R67 et R74 sont dans le domaine du bouchon, des positions apparemment appropriées pour influencer l'orientation d'un signal entrant dans le canal fermé. Pour tester le rôle du domaine plug dans l'orientation du signal et son importance pour la fonctionnalité du translocon et la viabilité cellulaire, des mutations spécifiques ont été introduites pour perturber sa structure, y compris une délétion complète. Étonnamment, la mutation ou la suppression du domaine plug n'a pas affecté la viabilité ou la croissance, malgré une efficacité de translocation et une formation de translocon réduites.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Construction plasmidique

Le plasmide pUC21ΔBB a été construit en clivant pUC21 (11) avec BamBonjour et BglII suivi d'une ligature pour supprimer le fragment entre les deux sites le plasmide résultant n'a ni un Bambonjour ni un BglII site de restriction. Le plasmide pUC21-NotI a été construit en insérant le 123 pb PasI fragment polylinker du plasmide pFA6b (12) dans pUC21ΔBB qui avait été clivé avec PasI. Une stratégie similaire a été utilisée pour construire des vecteurs équivalents avec un marqueur de résistance à la kanamycine, pUK21ΔBB et pUK21-NotI, en commençant par le plasmide pUK21 (11).

Plasmide HO-poly-HO a été construit en plusieurs étapes. Un fragment de 912 pb (HO-L) avec des séquences du HO (-2720 à -1814 en amont de l'ATG) a été fabriqué par PCR avec des amorces conçues pour générer un fragment avec HinDIII et BsiSéquences en surplomb WI (voir ci-dessous). Ce fragment a été inséré dans HinDIII–BsiWI a digéré pUC21-NotI. Un fragment de 507 pb (HO-R) avec des séquences de l'extrémité 3' du HO (+1199 à +1699 en aval de l'ATG) a été fabriqué par PCR avec des amorces conçues pour générer un fragment avec ÉcoRI et SfiJe surplombe des séquences (voir ci-dessous). Ce fragment a été inséré dans ÉcoIR–SfiJ'ai digéré pUC21-NotI. Plasmide HO-poly-KanMX4-HO a été construit en insérant le 1494 pb BsiWI-ÉcoFragment RI avec KanMX4 du plasmide pFA6-KanMX4 (12) dans BsiWI-ÉcoRI digéré HO-poly-HO. Plasmide HO-hisG-URA3-hisG-poly-HO a été construit en insérant le 3853 pb BamSALUT-BglII fragment avec le hisG-URA3-hisG cassette (8) dans BamHI digéré HO-poly-HO.

L'amplification par PCR du HO-L a été réalisée en utilisant la méthode de « clonage par PCR à extrémité collante » (13) en utilisant quatre amorces, F852-F855 (tableau 1). En bref, cette méthode consiste à effectuer deux réactions PCR suivies d'une fusion et d'un annelage de l'ADN. La PCR avec les amorces F852 et F854 donne un fragment aux extrémités franches où chaque extrémité contient 5 pb soit du HinDIII ou BsiSites de reconnaissance WI. Dans une réaction séparée, la PCR avec les amorces F853 et F855 donne un fragment aux extrémités franches où chaque extrémité contient 1 pb nécessaire à la HinDIII ou BsiSites de reconnaissance WI. Les deux réactions PCR sont mélangées, fondues à 100°C puis lentement refroidies pour permettre l'hybridation de l'ADN. Cet annelage d'ADN donne quatre types de produits d'ADN, avec des extrémités différentes. Un quart des produits d'ADN ont des surplombs pour le clonage dans le vecteur digéré avec HinDIII et BsiWI. Cette méthode élimine l'étape parfois problématique de digestion par restriction des produits d'ADN après amplification par PCR. La même méthode a été utilisée pour préparer les HO-Fragment R utilisant les amorces F856-F859.


RÉSULTATS

Sla1p se localise sur les patchs d'actine corticale

La suppression de SLA1 rend les cellules sensibles à la température pour la croissance et ont des défauts d'actine associés caractérisés par des plaques corticales moins nombreuses et plus grandes (Holtzman et al., 1993). Pour déterminer si les effets des mutations dans SLA1sur l'organisation de l'actine pourrait être directe, la localisation subcellulaire de Sla1p a été déterminée. D'autres gènes, comme ANC1, qui code pour une protéine nucléaire, provoquent des défauts d'actine lorsqu'ils sont supprimés, bien que leurs produits géniques ne soient pas localisés dans le cytosquelette d'actine (Welch et Drubin, 1994). Un antisérum a été élevé aux acides aminés 854 à 920 de Sla1p. Après purification par affinité, cet antisérum a reconnu une seule protéine de 148 kDa (par rapport à un poids moléculaire prédit de 136 kDa) sur des Western blots (figure 1A). La figure 1, B et C, montre la colocalisation de Sla1p avec un sous-ensemble des patchs d'actine corticale. La colocalisation de Sla1 aux câbles d'actine n'a pas été observée. De plus, il n'y avait pas de coloration détectable danssla1 cellules nulles (nos résultats non publiés). Nous avons également généré une version myc-tagged de Sla1p, qui a révélé un motif de coloration similaire à celui obtenu avec les anticorps anti-Sla1p (nos résultats non publiés). Les données de fluorescence démontrent que Sla1p est bien placé pour jouer un rôle direct dans l'organisation de l'assemblage d'actine au niveau du cortex des cellules de levure.

Fig. 1. Localisation de Sla1p et d'actine par microscopie indirecte d'immunofluorescence double marqueur. (A) Des anticorps dirigés contre Sla1p ont été utilisés pour détecter Sla1p sur des Western blots de cellules de type sauvage et pour démontrer le manque de protéines réactives dans sla1 cellules nulles. (B et C) Une microscopie par immunofluorescence a ensuite été réalisée pour localiser Sla1p (C) et l'actine (B) dans des cellules diploïdes de type sauvage. Barre, 5 m.

Localisation des protéines associées à l'actine en l'absence de Sla1p

De nombreuses protéines présentent une colocalisation complète ou partielle avec des patchs d'actine corticale. D'autres protéines telles que la Rab-GTPase Sec4p ne colocalisent pas avec l'actine mais dépendent néanmoins d'un cytosquelette d'actine intact pour obtenir une localisation polarisée au site du bourgeon présumé et dans le bourgeon des cellules en croissance. Pour explorer le rôle possible de Sla1p dans la localisation de telles protéines, 11 protéines associées au cortex ont été localisées avec l'actine dans des cellules de type sauvage etsla1 cellules nulles. Parmi les protéines testées qui sont connues pour se lier à l'actine ou qui présentent une colocalisation significative avec l'actine, la plupart ont continué à le faire même lorsque l'actine a perdu sa structure de "patch" de type sauvage dans sla1 cellules nulles. Cette catégorie comprenait Abp1p, Sac6p, cofilin, Srv2p, Arp2p et Las17p/Bee1p (Drubin et al., 1988 Lune et al., 1993 Freeman et al., 1996 Moreau et al., 1996 Li, 1997), comme illustré sur la figure 2, A et B, pour Abp1p. De plus, trois protéines (Cdc42p, calmoduline et Spa2p) qui sont fortement polarisées dans les cellules mais ne colocalisent pas avec l'actine (Snyder, 1989 Brockerhoff et Davis, 1992 Ziman et al., 1993) localisée normalement en l'absence de Sla1p (nos résultats non publiés). En revanche, deux autres protéines ont montré des altérations significatives de leur localisation dans sla1 cellules nulles. Sla2p, qui a une région C-terminale avec une homologie avec la taline (Holtzman et al., 1993 Rath et al., 1993) et se lie à l'actine in vitro (McCann et Craig, 1997), et qui montre une colocalisation substantielle avec des plaques d'actine corticales in vivo (Yang, Cope et Drubin, observations non publiées), ne colocalise pas avec l'actine en l'absence de Sla1p. Plutôt que de s'associer aux morceaux d'actine dans sla1 cellules nulles, Sla2p se trouve dans de petites taches à la périphérie de la cellule (Figure 2, C et D). De plus, Sla2p n'est pas aussi bien polarisé en l'absence de Sla1p que dans les cellules de type sauvage. La pénétrance du phénotype de non-colocalisation du patch d'actine corticale/Sla2p a été évaluée en comptant 100 cellules dans chacune des trois expériences de costaining. Dans les cellules de type sauvage, les patchs Sla2p ont montré une colocalisation avec un sous-ensemble de patchs d'actine dans 88 % des cellules comptées. Dans les cellules dans lesquelles Sla1p n'était pas exprimé, cependant, seulement 24% des cellules présentaient une colocalisation des patchs Sla2p avec des structures d'actine corticales. Il faut cependant noter que l'endocytose, qui nécessite Sla2p (Raths et al., 1993) n'est pas sévèrement touché en Δsla1 cellules (Ayscough, observation non publiée).

Fig. 2. Localisation des protéines en l'absence de Sla1p.sla1 les cellules nulles ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique et examinées par microscopie d'immunofluorescence à double marqueur. (A et B) Cellules marquées pour Abp1p (A) et actine (B). (C et D) Cellules colorées pour Sla2p (C) et actine (D). Barre, 5 m.

La deuxième protéine qui se localise de manière aberrante en l'absence de Sla1p est Rho1p. Les anticorps générés et purifiés par affinité contre un peptide Rho1p (voir MATÉRIELS ET MÉTHODES) ont reconnu une protéine de taille appropriée par Western blot, et la préincubation des anticorps avec le peptide a bloqué cette reconnaissance (Figure 3A). De plus, cette bande a augmenté en intensité lorsque RHO1 était surexprimé (figure 3B). Lorsque les anticorps ont été utilisés pour l'immunolocalisation dans des cellules de type sauvage, Rho1p a été trouvé dans un patch sur le site où l'émergence du bourgeon se produira, à l'extrémité du nouveau bourgeon, puis autour du cortex du bourgeon à mesure qu'il grandit (Figure 3C ), comme décrit précédemment (Yamochi et al., 1994). En l'absence de Sla1p, bien que la localisation de Rho1p était relativement normale pendant la formation des bourgeons, de nombreuses cellules non bourgeonnées présentaient une coloration sur tout le cortex cellulaire (figure 3D). En revanche, dans les cellules de type sauvage, peu ou pas de coloration corticale générale était apparente dans les cellules non bourgeonnées (figure 3C). Les dénombrements ont montré que près de 50 % des sla1les cellules nulles ont montré une coloration corticale inappropriée (figure 3E).

Fig. 3. Suppression de SLA1 affecte la localisation de Rho1p. (A et B) Immunoblots de lysats de cellules entières (10 g/piste) sondés avec des anticorps anti-Rho1p purifiés par affinité. (A) Lysat de cellules de type sauvage (DDY664) sondé avec des anticorps non traités (piste de gauche) ou avec les mêmes anticorps après préincubation avec l'antigène peptidique Rho1p (piste de droite). (B) Lysats de DDY1097 (portant unFILLERHO1 plasmide piste de droite) et DDY1098 (portant un plasmide témoin) ont été préparés après croissance sur galactose pendant 8 h et sondés avec les anticorps anti-Rho1p (en bas) ou (en tant que témoin de charge) avec des anticorps anti-β-tubuline (en haut). (C et D) Immunolocalisation de Rho1p dans des cellules en phase log de type sauvage (C) et sla1 cellules nulles (D) Bar, 5 um. (E) Les modèles de coloration des cellules non bourgeonnées ont été comptés. Les données présentées sont les moyennes de trois expériences dans lesquelles au moins 200 cellules non bourgeonnées ont été notées. La tache unique de coloration dans les cellules non bourgeonnées de type sauvage est probablement le site à partir duquel le nouveau bourgeon émergera.

Auparavant, nous avons montré qu'en présence de la latrunculine-A, un médicament perturbant l'actine, Sla1p était capable de se localiser dans le cortex cellulaire mais était incapable de se polariser sur le site du bourgeon naissant (Ayscough et al., 1997). Le résultat présenté ici montrant une dépendance de Rho1p sur Sla1p pour sa localisation suggérerait que Rho1p devrait également être incapable de se polariser en l'absence d'un cytosquelette d'actine intact. Nous avons testé la dépendance de la localisation de Rho1p vis-à-vis de la F-actine comme décrit dans Ayscough et al. (1997) et ont observé que Rho1p était capable de se localiser dans le cortex cellulaire en présence de latrunculine-A mais n'était pas polarisé aux extrémités de la cellule (nos résultats non publiés). Un décompte des cellules a révélé que plus de 70 % des cellules présentaient une coloration corticale mais non polarisée de Rho1p et 13 % présentaient une coloration à la fois sur l'ensemble du cortex et sur un patch à une extrémité d'une cellule. Les cellules restantes n'ont montré aucune coloration détectable pour Rho1p.

Rho1p régule l'enzyme de synthèse de la paroi cellulaire 1,3-β-glucan synthase (Drgonová et al., 1996 Qadota et al., 1996). Étudier si la localisation anormale de Rho1p dans sla1 les cellules nulles ont affecté le dépôt de la paroi cellulaire, nous avons utilisé la microscopie électronique. Comme le montre la figure 4, le sla1 les cellules mutantes nulles ont montré un épaississement aberrant des parois des cellules mères et non bourgeonnées. Cet épaississement semblait être uniforme sur toute la surface des cellules mères et non bourgeonnées, mais ne s'étendait pas aux bourgeons (figure 4B), ce qui correspond à la localisation relativement normale de Rho1p dans les cellules en herbe (voir ci-dessus).

Fig. 4. Les cellules nulles sla1 ont des parois cellulaires épaisses. (A) de type sauvage et (B) Δsla1 les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique, puis fixées et traitées pour la microscopie électronique en utilisant une fixation au permanganate de potassium pour améliorer la visualisation de la paroi cellulaire et des membranes.

L'expression des formes mutantes de Sla1p définit les domaines fonctionnels au sein de la protéine

La séquence primaire de Sla1p suggère qu'il existe des éléments structurels dans la protéine qui pourraient être responsables de fonctions et d'interactions spécifiques. Une série de sla1 les mutants de délétion (Figure 5) ont été exprimés danssla1 cellules nulles pour explorer cette possibilité. Les Western blots ont vérifié que des niveaux similaires de Sla1p étaient exprimés dans les cellules portant les différentes constructions (nos résultats non publiés), indiquant que les stabilités des protéines mutantes Sla1 n'étaient pas significativement diminuées.

Fig. 5. Mutant sla1 construits. Les détails de la construction du plasmide sont donnés dans le tableau 2.

Nous avons ensuite déterminé si les protéines mutantes Sla1 étaient capables de sauver deux phénotypes associés à la délétion de SLA1, croissance sensible à la température et dépendance à Abp1p. Les transformants ont été étalés sur des milieux sélectifs appropriés à 25° ou 37°C (Figure 6A). Toutes les constructions sauf une, Sla1-ΔG1+SH3#3, ont pu sauver la sensibilité à la température du sla1 mutant nul. Il manquait à cette construction la région entre les deuxième et troisième domaines SH3 (Gap1) et également le troisième domaine SH3 (figure 5). Fait intéressant, les mutants dépourvus de Gap1 seul ou du troisième domaine SH3 seul ont pu soutenir la croissance à la température non permissive. De plus, une autre construction, Sla1-ΔG2, n'a supporté qu'une faible croissance à 37°C.

Fig. 6. Croissance de cellules contenant des protéines Sla1 mutantes. (A) Cellules dans lesquelles la copie génomique de SLA1 a été supprimé (KAY14) ont été transformés avec le sla1 constructions mutantes et étalées sur un milieu sélectif à 25° et 37°C. (B) Cellules portant ABP1 sur un URA3plasmide marqué (KAY78) ont été transformés avec le sla1 constructions mutantes et testées pour la croissance sur milieu sélectif en présence ou en l'absence de 5-FOA. (C) Les cellules (KAY14) ont été cotransformées avec sla1constructions mutantes Sla1-ΔC-term.rpts et Sla1ΔGap1+SH3#3 et testées pour la croissance à 37°C. L'expression des deux formes de Sla1p a été vérifiée par Western blot.

Le sauvetage du phénotype Abp1p-dépendance a été testé par placagesla1 abp1 cellules doublement mutantes qui portaient unURA3-marqué ABP1 plasmide et a exprimé les différents sla1 des constructions mutantes sur un milieu contenant du 5-FOA, qui sélectionne contre le ABP1- portant un plasmide (figure 6B). Dans ces cellules, ABP1 n'était présent que sur unURA3-plasmide marqué. En l'absence de Sla1p, ces cellules ne peuvent pas croître sans le ABP1 plasmide et par conséquent ne peut pas se développer sur des plaques 5-FOA. Parmi les formes mutantes de Sla1p, seules les cellules exprimant des répétitions Sla1-ΔC-terminales n'ont pas réussi à sauver la dépendance à Abp1p. Ce résultat suggère que cette région répétée est impliquée dans une fonction redondante avec celle d'Abp1p.

Dans cette première analyse, nous avions identifié une protéine mutante qui a sauvé la dépendance Abp1p du sla1 mutant nul mais pas sa sensibilité à la température et un second qui a sauvé la sensibilité à la température mais pas la dépendance Abp1p. Pour tester si les deux fonctions Sla1p pouvaient être réalisées dans des transformants, les deux constructions mutantes ont été cotransformées en sla1 cellules nulles. Les transformants se sont développés très mal à 37°C (figure 6C), suggérant que Sla1-ΔG1+SH3#3 inhibe de manière compétitive les répétitions Sla1-ΔC-terminales (Sla1-ΔC-term.rpts).

Organisation de l'actine dans les cellules exprimant les formes mutantes de Sla1p

Comme mentionné ci-dessus, sla1 les mutants nuls ont moins de plaques d'actine corticales, et ces plaques semblent plus grandes et moins polarisées que la normale (Figure 7, B et C). Pour évaluer si ce phénotype d'actine aberrant peut être attribué à un domaine particulier de Sla1p, nous avons coloré des cellules exprimant les différents mutants Sla1p avec la Rd-phalloidine. Les cellules avec des taches d'actine corticale de type sauvage ou aberrantes ont été comptées, et ceci est résumé sur la figure 7A. Les cellules représentatives de trois des mutants sont illustrées à la figure 7, D–F. Les cellules exprimant Sla1-ΔG1+SH3#3 (Figure 7D) avaient le phénotype d'actine le plus sévère, similaire à celui de sla1cellules nulles, indiquant que ce domaine joue un rôle essentiel dans la régulation de l'organisation de l'actine corticale. En revanche, les cellules exprimant la plupart des autres formes mutantes de Sla1p avaient un motif de coloration presque impossible à distinguer de celui des cellules de type sauvage. Par exemple, la figure 7E montre le motif de coloration pour les répétitions Sla1-ΔC-terminal. Ainsi, ces protéines contiennent les informations nécessaires au maintien d'une organisation normale du cytosquelette d'actine corticale. Certains des mutants, y compris Sla1-ΔSH3#1&2 et Sla1-ΔGap1, ont un phénotype d'actine partiellement pénétrant avec ∼15-20% des cellules de la population ayant des morceaux d'actine, bien que les cellules restantes aient un aspect d'actine de type sauvage (Figure 7F, Sla1-ΔSH3#1&2).

Fig. 7. Organisation de l'actine dans des cellules exprimant des formes mutantes de Sla1p. Les cellules en phase logarithmique ont été traitées pour la coloration à la Rd-phalloidine. (A) Pour chaque mutant, au moins 300 cellules ont été notées pour la morphologie du patch d'actine de type sauvage ou aberrant. Des images représentatives de la coloration de l'actine sont présentées pour les cellules exprimant (B) Sla1p de type sauvage, (C) pas de Sla1p, (D) Sla1-ΔG1+SH3#3, (E) Sla1-ΔC-terminal répétitions, (F) Sla1- SH3#1&2. Barre, 5 m.

Nous avons également effectué une microscopie par immunofluorescence à double marquage pour l'actine et Sla2p dans des cellules exprimant des formes mutantes de Sla1p (nos résultats non publiés). Nos résultats ont indiqué que le découplage de Sla2p et la localisation du patch d'actine corticale est en corrélation avec la gravité du défaut d'actine plutôt qu'avec un domaine spécifique de liaison à Sla2p dans Sla1p.

Analyse du rôle de Sla1p à l'aide d'un test cellulaire perméabilisé

Un essai de cellules perméabilisées in vitro a été utilisé pour tester davantage le rôle de Sla1p dans la régulation de l'assemblage du patch d'actine. Le test mesure l'assemblage nucléé de rhodamine-actine ajoutée de manière exogène dans des plaques polarisées au niveau du cortex des cellules perméabilisées (Li et al., 1995). Ces patchs ressemblent à ceux observés in vivo en termes de taille et de distribution (figure 8A). Comme indiqué précédemment (Liet al., 1995), perméabilisé sla1 les cellules nulles sont incapables de supporter l'assemblage d'actine nucléée et n'affichent qu'un faible niveau de fond de fluorescence rhodamine-actine qui n'est jamais assemblée en plaques corticales (figure 8B). sla1 cellules nulles exprimant trois des mutants sla1 les constructions ont été examinées, et les données ont été quantifiées et exprimées en tant que gamme d'intensités de fluorescence mesurées dans les bourgeons des cellules à petits bourgeons. Les cellules exprimant les répétitions Sla1-ΔSH3#1&2 ou Sla1-ΔC-terminal ont assemblé des plaques polarisées distinctes de rhodamine–actine ressemblant à celles observées dans les cellules de type sauvage, et les niveaux de fluorescence étaient quelque peu similaires à, ou (pour Sla1-ΔSH3#1&2) supérieures à celles observées dans les cellules de type sauvage (figures 8, C et E).

Fig. 8. Incorporation de rhodamine–actine dans des cellules perméabilisées exprimant des formes mutantes de Sla1p. Cellules exprimant (A) Sla1p de type sauvage, (B) pas de Sla1p, (C) Sla1-ΔSH3#1&2, (D) Sla1-ΔG1+SH3#3, (E) Sla1-ΔC-term. les répétitions ont été cultivées, perméabilisées et testées pour l'assemblage d'actine comme décrit par Liet al., (1995) (voir MATÉRIAUX ET MÉTHODES). Les sites d'incorporation ont ensuite été visualisés par microscopie à fluorescence, et l'intensité de fluorescence dans les bourgeons a été mesurée. Les unités d'intensité de fluorescence sont arbitraires. Barre, 5 m.

En revanche, la suppression de la région Gap1 et du troisième domaine SH3 ensemble, mais d'aucun des deux seuls, a rendu les cellules totalement défectueuses dans l'incorporation de la rhodamine-actine dans les structures corticales de l'actine (figure 8D).

Pour étudier plus avant l'importance de Sla1p dans l'assemblage des patchs d'actine, des extraits cellulaires ont été rajoutés à des sla1cellules nulles pour tenter de reconstituer l'activité d'assemblage d'actine. L'activité pourrait en effet être restaurée par l'ajout d'extraits cellulaires de type sauvage, mais des extraits de sla1 les cellules nulles ou issues de cellules n'exprimant que Sla1-ΔG1+SH3#3 n'ont pas pu restaurer l'activité d'assemblage d'actine (Eby et Ayscough, données non publiées voir MATERIAUX ET METHODES). Ces données appuient davantage la conclusion selon laquelle Sla1p joue un rôle direct dans la régulation du cytosquelette d'actine cortical.

Un homologue de levure de fission de SLA1 peut sauver la sensibilité à la température des cellules nulles de S. cerevisiae sla1

Un homologue complet de SLA1 a été identifié dans leS. pombe base de données du génome. Bien que la similarité de séquence globale ne soit pas élevée (27 %), la valeur prédite S. pombeLa protéine contient les mêmes domaines reconnaissables de Sla1p, y compris trois domaines SH3, un motif en hélice proline et une région répétée C-terminale (figure 9A). De plus, dans le tiers central des protéines se trouvaient deux régions non apparentées, chacune d'environ 60 acides aminés, qui étaient plus similaires (58 et 60 % d'identité, respectivement) que toute autre partie de la protéine (figure 9A). Ces domaines ne partagent pas d'homologie significative avec d'autres séquences dans les bases de données accessibles au public. Les antisérums élevés à S. cerevisiae Sla1p n'a pas reconnu une protéine de la taille appropriée sur un Western blot de S. pombe protéines, et ils n'ont pas non plus donné un motif de coloration distinct par immunofluorescence. Les S. pombe sla1 gène a été cloné à partir d'ADN cosmidique dans un vecteur de surexpression et transformé en S. cerevisiae cellules dans lesquellesSLA1 avait été supprimé. Les S. pombe Le gène a été capable de récupérer partiellement la sensibilité à la température associée à la délétion (Figure 9, B et C), cependant, la coloration de ces cellules pour l'actine a indiqué que leur organisation aberrante de l'actine n'a pas été sauvée par le gène de la levure à fission.

Fig. 9. Le S. pombe homologue deSLA1 sauve la sensibilité à la température de S. cerevisiae sla1cellules. (UNE) S. pombe Sla1p a une structure de domaine similaire à celle de S. cerevisiaeSla1p. Deux régions de forte homologie sont désignées SHD (Sla1p homology domain) 1 et 2. Les pourcentages d'identité des domaines SH3 et des régions SHD sont notés sous les motifs respectifs. Croissance deS. cerevisiae sla1 cellules nulles (KAY14) contenantS. cerevisiae SLA1, S. pombe sla1, ou le vecteur seul a été testé à (B) 29°C et (C) 37°C.


États oligomères alternatifs du complexe de levure Rvb1/Rvb2 induits par les balises histidine

Rvb1 et Rvb2 sont indispensables AAA+ (UNETPases uneassocié à divers cellulaires unectivités) hélicases, qui sont des composants importants de complexes critiques tels que le remodelage de la chromatine et les complexes de télomérase. L'état oligomérique des protéines Rvb a été controversé. Independent studies from several groups have described the yeast and human Rvb1/Rvb2 complex both as a single and as a double hexameric ring complex. We found that histidine-tagged constructs of yeast Rvb proteins employed in some of these studies induced the assembly of double hexameric ring Rvb1/Rvb2 complexes. Instead, untagged versions of these proteins assemble into single hexameric rings. Furthermore, purified endogenous untagged Rvb1/Rvb2 complexes from Saccharomyces cerevisiae were also found as single hexameric rings, similar to the complexes assembled in vitro from the purified untagged components. These results demonstrate that some of the differences between the reported structures are caused by histidine tags and imply that further studies on the purified proteins should be carried out using untagged constructs.


Yeast are first cells known to cure themselves of prions

When colonies of baker's yeast cells that contain clumped prion proteins (colonies of white cells on left) are stressed by high temperatures, some can convert the aggregated prion proteins to the non-clumping form of the protein (red cells in the colonies the right). Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

Yeast cells can sometimes reverse the protein misfolding and clumping associated with diseases such as Alzheimer's, according to new research from the University of Arizona.

The new finding contradicts the idea that once prion proteins have changed into the shape that aggregates, the change is irreversible.

"It's believed that when these aggregates arise that cells cannot get rid of them," said Tricia Serio, UA professor and head of the department of molecular and cellular biology. "We've shown that's not the case. Cells can clear themselves of these aggregates."

Prions are proteins that change into a shape that triggers their neighbors to change, also. In that new form, the proteins cluster. The aggregates, called amyloids, are associated with diseases including Alzheimer's, Huntington's and Parkinson's.

"The prion protein is kind of like Dr. Jekyll and Mr. Hyde," said Serio, senior author of the paper published today in the open-access journal eLife. "When you get Hyde, all the prion protein that gets made after that is folded in that bad way."

For yeast, having clumps of amyloid is not fatal. Serio and her students exposed amyloid-containing cells of baker's yeast to 104 F (40 C), a temperature that would be a high fever in a human. When exposed to that environment, the cells activated a stress response that changed the clumping proteins back to the no-clumping shape.

The finding suggests artificially inducing stress responses may one day help develop treatments for diseases associated with misfolded prion proteins, Serio said.

"People are trying to develop therapeutics that will artificially induce stress responses," she said. "Our work serves as a proof of principal that it's a fruitful path to follow."

First author on the paper "Spatial quality control bypasses cell-based limitations on proteostasis to promote prion curing" is Serio's former graduate student Courtney Klaips, now at the Max Planck Institute for Biochemistry in Munich. The other authors are Serio's students Megan Hochstrasser, now at the University of California, Berkeley, and Christine Langlois of Brown University.

National Institute of Health grants R01 GM069802001, F31 AG034754 and F31 GM099383 funded the research.

These yeast cells contain a prion protein that can change shape from a non-clumping form to one that aggregates into clumps called amyloids. Proteins in these cells have the non-clumping shape and are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

To accomplish their jobs inside cells, proteins must fold into specific shapes. Cells have quality-control mechanisms that usually keep proteins from misfolding. However, under some environmental stresses, those mechanisms break down and proteins do misfold, sometimes forming amyloids.

Cells respond to environmental stress by making specific proteins, known as heat-shock proteins, which are known to help prevent protein misfolding.

Serio and her students wanted to know whether particular heat-shock proteins could make amyloids revert to the normal shape. To that end, the team studied yeast cells that seemed unable to clear themselves of the amyloid form of the prion protein Sup35.

The researchers were testing one heat-shock protein at a time in an attempt to figure out which particular proteins were needed to clear the amyloids. However, the results weren't making sense, she said.

So she and Klaips decided to stress yeast cells by exposing them to a range of elevated temperatures - as much as 104 F (40 C) - and let the cells do what comes naturally.

As a result, the cells made a battery of heat-shock proteins. The researchers found at one specific stage of the cell's reproductive cycle, the yeast could turn aggregates of Sup35 back into the non-clumping form of the protein.

Yeast cells reproduce by budding. The mother cell partitions off a bit of itself into a much smaller daughter cell, which separates and then grows up.

The researchers found in the heat-stressed yeast, just when the daughter was being formed, the mother cell retained most of the heat-shock proteins called chaperones, especially Hsp-104. As a result, the mother had a particularly high concentration of Hsp-104 because little of the protein was shared with the daughter.

The fluorescent green chunks in these yeast cells are prion proteins that have assumed the shape that aggregates into clumps called amyloids. The prion proteins in these cells are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

The mother cells ended up "curing" themselves of the Sup35 amyloid, although the daughters did not. The degree of curing was correlated with the concentration of Hsp-104 in the cell, and the higher the temperature the more Hsp-104 the cells had.

The Hsp-104 takes the protein in the amyloid and refolds it, Serio said. But she and her colleagues found that just inducing high levels of Hsp-104 in cells by itself does not change the amyloid protein back to the non-clumping form.

"Clearly the heat-shock proteins are collaborating in some way that we don't understand," she said.

Having the amyloid-forming version of the protein is not automatically bad, she said. It may be that shape is good under some environmental conditions, whereas the non-aggregating form is good under others.

Even in humans, amyloid forms of a protein can be helpful, she said. Amyloid proteins are associated with skin pigmentation and with hormone storage.

To clear the amyloid from yeast cells, these experiments triggered cells to make many different heat-shock proteins.

Serio now wants to figure out the minimal system necessary to clear amyloids from a cell. Knowing that may help the development of drug therapies for amyloid-related human diseases, she said.


Remerciements

This work was supported by the European Commission (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network “HONOURS” grant agreement no. 721367), the Swiss National Science Foundation (SNF grants CRSII3_160780 and 310030_173085), the German Research Council (DFG grants SFB-TR84 (TRR 84/3, A07) and DR 772/7-2), the Federal Ministry of Education and Research (BMBF grant RAPID, 01KI1723A) and by core funds of the University of Bern. We thank S. Vashee for the provision of the TAR vectors and for discussions related to his herpesvirus work J. Peters Zocher for her advice in generating the figures F. Suter-Riniker and P. Bittel for providing clinical samples staff from the Next Generation Sequencing platform (University of Bern) and M. Schweizer, P. Plattet, M. Gerber, M. Friesland, M. Alves, N. Vielle, B. Zumkehr, M. Brügger and D. Brechbühl for reagents, technical advice and helpful discussions. This study is dedicated to S. Kunz.


Résultats et discussion

Efficient Construction of Yeast Homozygous Diploid Strains

Our strategy for construction of homozygous diploid cells is shown in Figure 1B . As a host strain, we used either a TAPIS une ou TAPIS α haploid strain carrying i) PSTE18-URA3, which expresses the URA3 gene under the control of haploid specific STE18 (G-protein γ subunit) promoter [11] and ii) PGAL1-HO, which expresses the HO endonuclease under the control of GAL1 promoter (repressed by glucose and induced by galactose [12]). Once the host strain is transiently incubated on galactose plates (HO induction) , the mating-type switch (TAPIS uneTAPIS α ou TAPIS αTAPIS une) occurs and consequently diploid cells are formed by mating of TAPIS une et TAPIS α cells within colonies. Following short induction times of HO (㰒 hours), the colonies contain three cell types, TAPIS une, TAPIS α, et TAPIS une / α. Our strategy can select diploids by counter selection using 5-FOA, where haploids cannot grow because Ura3 (orotidine-5′-phosphate decarboxylase) converts 5-FOA into a toxic compound [13], while diploids are resistant to 5-FOA because URA3 is not expressed. Leaky expression of HO does not matter as long as the host strain is maintained on plates lacking uracil.

First, we investigated whether the PSTE18-URA3 gene allows selecting for diploid cells. We constructed wild-type PSTE18-URA3 et hog1Δ PSTE18-URA3 strains in the three cell types (TAPIS une, TAPIS α, et TAPIS une / α) and grew them on SC plates lacking uracil or containing 0.1% 5-FOA. As shown in Figure 2A , the haploid and diploid PSTE18-URA3 strains showed the expected phenotypes, i.e. the haploid strains were uracil prototrophic and 5-FOA sensitive, and the diploid strains were uracil auxotrophic and 5-FOA resistant. Moreover, the haploid cells that germinated from spore progeny of the diploid PSTE18-URA3 strains displayed uracil prototrophy and 5-FOA sensitivity ( Figure 2B ). Taken together, these results demonstrate that the PSTE18-URA3 gene can be used as a diploid selection marker.

(A) The haploid and diploid PSTE18-URA3 strains display opposite growth phenotypes on plates lacking uracil or containing 5-FOA. The strains were grown for 2𠄳 days at 30ଌ. (B) The growth phenotype of the diploid PSTE18-URA3 strain can revert to that of haploid after sporulation. The indicated diploid strains were sporulated, tetrads were dissected and spore progeny was grown on YPD plate for 3 days at 30ଌ. Then, the cells were replicated on the indicated plates and grown for 2𠄳 days at 30ଌ.

Next, we determined the efficiency of construction of diploids by our strategy. The wild-type PSTE18-URA3 et hog1Δ PSTE18-URA3 souches (TAPIS une et TAPIS α) carrying pJH283 (PGAL1-HO) were grown overnight on galactose plate, and then cells were restreaked on SC plate containing 0.1% 5-FOA. The single colonies obtained on the 5-FOA plate were analyzed by two methods: i) observation of pseudohyphal growth on SLAD plate, and ii) determination of mating type by PCR. All of the single colonies analyzed (10 colonies for each strain) showed diploid specific patterns: i) strongly enhanced pseudohyphal growth (data not shown), and ii) two PCR bands corresponding to diploids (Figure S1). These results indicate that our method is highly efficient for construction of diploid strains.

Screening Suppressor Mutations of Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

To demonstrate that our strategy for construction of diploid strains is useful for genetic studies of diploid-specific developments, we applied it to yeast filamentous growth in the � background. Transposon insertion mediated-random mutagenesis and -systematic gene disruption have previously been employed to dissect the genetic bases of filamentous growth [14], [15]. However, these studies used haploid strain backgrounds in which filamentous growth was ectopically induced by an extra copy of the opposite mating-type locus and the PHD1 gene (transcriptional activator for filamentation) or by adding 1% butanol to the growth medium. In addition, however, homozygous diploid strains must be used to analyze the genetics of filamentous growth. We have recently reported that hyperosmotic stress inhibits all of the yeast morphological developments and that the Hog1 MAPK is a central negative regulator of these developments [10]. Moreover, the effect of HOG1 deletion is reflected in diploids more clearly than in haploids [16]. Therefore, suppressor mutations of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ are expected to lead to the identification of genes involved in controlling those phenotypes. In the present study, we screened suppressor mutations of complex colony morphology, strong invasive growth, and hyper-filamentous growth in the � hog1Δ/hog1Δ background by constructing homozygous double mutants (i.e. xxx::mTn/xxx::mTn hog1Δ/hog1Δ).

Following the strategy shown in Figure 3A , a transposon insertion mutagenesis was performed using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO) as a host strain. Since the diploid hog1Δ/hog1Δ strain displays complex colony morphology even on YPD plates while the diploid wild-type strain does not [10], [16], mutant strains defective in formation of complex colony morphology were first screened by visual inspection ( Figure 3B ). From more than six thousand 5-FOA resistant strains (candidates for homozygous diploids) which were obtained at 93% success rate of randomly picked transformants, we isolated more than 100 mutant strains that showed smooth- or less complex-colony morphology. The diploid state in those was confirmed by PCR analysis of the mating-type locus. We amplified the transposon insertion regions of these strains by vectorette PCR and sequencing of the PCR products identified 49 unique genes ( Table 1 and Table S1). Morphological developments (complex colony morphology, invasive growth, and filamentous growth) of all 49 homozygous double mutant strains on YPD plates were characterized, and the results are discussed below.

(A) Strategy for screening the suppressor mutations. Using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO::TRP1) as a host strain, transposon insertion mutagenesis was performed and mutant strains defective in complex colony morphology were screened by visual inspection. The details are described in Materials and Methods. (B) One example of the screening results is shown. The candidates, smooth colony or less complex colony, were further analyzed: identification of the transposon insertion position, mating-type PCR, and morphological assay for invasive growth and filamentous growth.

Tableau 1

GèneCCMIGFGDescription of gene productRéférence
ADE6– –– –Formylglycinamidine-ribonucleotide (FGAM)-synthetaseCette étude
AMN1– –Protein required for daughter cell separation, multiple mitotic checkpoints, and chromosome stability [15]
ATO2– –– –+Putative transmembrane protein involved in export of ammoniaCette étude
CLN1– –– –G1 cyclin involved in regulation of the cell cycle [16], [23]
DHH1– –– –Cytoplasmic DExD/H-box helicase [24]
FLO8– –– –– –Transcription factor required for flocculation, diploid filamentous growth, and haploid invasive growth [15], [20]
GCN2– –+Protein kinase that phosphorylates the alpha-subunit of translation initiation factor eIF2 [19]
HIR2– –Subunit of the HIR complex [15]
HIR3– –Subunit of the HIR complexCette étude
IES1+Subunit of the INO80 chromatin remodeling complexCette étude
IMP2′Transcriptional activator involved in maintenance of ion homeostasis and protection against DNA damageCette étude
KRE11+Subunit of the TRAPP II (transport protein particle) complexCette étude
KSS1– –– –– –Mitogen-activated protein kinase involved in filamentous growth and pheromone response [21]
MSN1– –Transcriptional activator involved in invertase expression and invasive growth/pseudohyphal differentiation [15], [26]
MTC5– –– –– –Subunit of the SEA (Seh1-associated) complexCette étude
RAD1– –– –Single-stranded DNA endonucleaseCette étude
RAD24+Checkpoint protein involved in the activation of the DNA damage and meiotic pachytene checkpointsCette étude
RAS2– –– –– –GTP-binding protein that regulates the nitrogen starvation response, sporulation, and filamentous growth [15], [16]
RDI1+Rho GDP dissociation inhibitor involved in the localization and regulation of Cdc42 [22]
RIM9– –– –– –Protein of unknown function involved in the proteolytic activation of Rim101p in response to alkaline pH [15], [27]
SHE10– –+Putative glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein of unknown functionCette étude
SIR3– –– –Silencing protein that interacts with Sir2p and Sir4p, and histone H3 and H4 tailsCette étude
SLP1Member of the SUN-like family of proteinsCette étude
SPT2– –Protein involved in negative regulation of transcriptionCette étude
STE7– –– –– –MAPK kinase involved in pheromone response and pseudohyphal/invasive growth [16], [21]
TCO89Subunit of TORC1, a complex that regulates growth in response to nutrient availabilityCette étude
TEC1– –– –– –Transcription factor required for haploid invasive and diploid pseudohyphal growth (TEA/ATTS family) [14], [15], [16]
UBP6Ubiquitin-specific proteaseCette étude
YDR306C– –– –+F-box protein of unknown functionCette étude
YHR177W– –– –– –Putative protein of unknown functionCette étude

Mitochondrial Function Is Essential for Complex Colony Morphology

Sixteen of the 49 strains displayed petite and smooth colony morphology (Figure S2) and were unable to grow on plates containing glycerol as a sole carbon source (data not shown). These phenotypes suggest impaired respiratory growth, and all of these mutations are indeed linked to mitochondrial functions (Table S1). We confirmed that a rhô 0 mutant (lacking mitochondria DNA) in the hog1Δ/hog1Δ background also displays petite and smooth colony morphology (Figure S2). Moreover, we identified three additional genes encoding proteins related to mitochondrial functions, ILM1, SCO1, et SDH1 (Table S1). These results indicate that mitochondrial function is essential for complex colony morphology. Jin et al. have previously shown that mitochondrial dysfunction inhibits filamentous growth through the retrograde signaling pathway, which is a mitochondria-to-nucleus pathway transducing changes in mitochondrial function to specific adaptive changes in nuclear gene expression [15]. ILM1 is known to be required for both mitochondrial function and slowed DNA synthesis-induced filamentous growth [17]. However, all of the mitochondria-related mutants identified by our screen poorly suppressed hyper-filamentous growth and strong invasive growth of the hog1Δ/hog1Δ strain (data not shown), suggesting that the hyper-filamentous phenotype of HOG1 deletion involves multiple mechanisms that are not simply suppressed by mitochondrial dysfunction. Alonso-Monge et al. have recently reported that the Candida albicans hog1 mutant shows an enhanced basal respiratory rate compared to the wild-type strain and suggested a link between Hog1 and mitochondrial function [18]. Therefore, it would be interesting to investigate whether and how Hog1 activated by hyperosmotic stress inhibits mitochondrial function during filamentous growth.

Multiple Mechanisms Are Necessary for the Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

In addition to the mitochondria-related mutations, we identified 30 mutations that suppress at least two of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ (Table S1) and representative mutants are shown in Figure 4 . Thirteen of the 30 genes have previously been reported to be involved in at least one of the three morphological developments in the S. cerevisiae � background [14], [15], [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Those genes include the well-known STE7, KSS1, TEC1, RAS2, et FLO8 that regulate filamentous growth via the MAPK or cAMP-PKA signaling pathway. These two signaling pathways converge on the regulation of the MUC1 (aussi connu sous le nom FLO11) gene [25], which encodes a GPI-anchored cell surface mucin required for morphological developments. DHH1 is involved in translational regulation of the Ste12 transcription factor which is regulated under the Kss1 MAPK pathway and essential for MUC1 expression [24]. GCN2 (general amino acid control system) and MSN1 (transcriptional activator) are involved in the regulation of MUC1 under certain nutrient conditions [19], [26]. Presumably, RIM9 is also important for the regulation of MUC1 through the pH-responsive Dfg16-Rim101 pathway [27]. Thus, our screen implies that impaired MUC1 expression is sufficient to suppress enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ. Indeed, deletion of the MUC1 gene in the hog1Δ/hog1Δ background lost the enhanced morphological developments and resulted in morphology similar to a muc1Δ/muc1Δ strain ( Figure 4 ).

CCM: complex colony morphology, IG: invasive growth, FG: filamentous growth. All other suppressor mutants identified are shown in Table 1 .

Seventeen of the 30 mutations occurred in genes not previously implicated in filamentous growth in S. cerevisiae. These gene products are involved in various cellular mechanisms, especially DNA damage checkpoint control (IMP2′, RAD1, et RAD24), gene expression via chromatin remodeling or histone-nucleosome assembly (HIR2, HIR3, IES1, SIR3, et SPT2), control of cell cycle or cell division (AMN1 et YHR177W), and other functions. Although the present study did not reveal the morphological suppressing mechanism by deletion of these genes or physical interactions between Hog1 and the identified targets, our screen could highlight the genetic networks that are required for the enhanced morphological developments independent of the filamentous growth signaling pathways. Since the active Hog1 (Hog1-D170A/F318S) strain inhibits all of the morphological developments in a hyperosmotic stress-independent manner [10], the mechanisms identified in our screen might be negatively regulated by Hog1. While crosstalk between the HOG and filamentous growth MAPK pathways is well established [28], the present mutant collection will enable further analyses of connections between the HOG pathway and other mechanisms. Such efforts can contribute to understanding mechanisms of filamentous growth common between model yeasts and pathogenic yeasts as well as devising novel antifungal targets.

In conclusion, we demonstrate that combinatorial use of the PGAL1-HO et PSTE18-URA3 genes is effective for construction of homozygous diploid strains and a useful tool when combined with large-scale screening. Genetic information of S. cerevisiae homozygous diploids obtained by the method proposed in this study may be useful for the studies of other organisms such as diploid Candida albicans in which construction of homozygous mutant strains is a difficult task.


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