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12.2J : Procédures d'immunotransfert - Biologie


L'immunoblot est une technique d'analyse des protéines via des réactions spécifiques antigène-anticorps.

Objectifs d'apprentissage

  • Décrire comment le Western blot permet aux individus de détecter des protéines solubilisées spécifiques à partir d'extraits de sérum ou de cellules ou de tissus

Points clés

  • Dans les techniques d'immunotransfert telles que l'analyse Western blot, les protéines sont séparées par électrophorèse et transférées sur des feuilles de nitrocellulose, puis sont identifiées par leur réaction avec des anticorps marqués.
  • L'électrophorèse utilise un courant électrique pour séparer les protéines en fonction de leur taille. Les grosses protéines migrent plus lentement et sont représentées par les bandes les plus hautes sur le transfert, tandis que les petites protéines migrent plus rapidement et sont indiquées par les bandes les plus basses sur le transfert.
  • Les tests d'immunotransfert sont généralement effectués pour confirmer les résultats obtenus par d'autres techniques telles que l'ELISA.

Mots clés

  • dodécyl sulfate de sodium: agent détergent puissant utilisé pour réduire et déplier les protéines natives.
  • tache: méthode de transfert de protéine, d'ADN ou d'ARN sur une membrane porteuse.

Les procédures d'immunotransfert telles que le transfert de protéines ou le transfert de Western permettent aux individus de détecter des protéines solubilisées spécifiques à partir d'extraits fabriqués à partir de cellules ou de tissus, avant ou après toute étape de purification.

Procédures d'immunoempreinte

Cette technique analytique se déroule selon les étapes suivantes. Les protéines sont généralement séparées par taille en utilisant une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium (SDS). Après cela, ils sont transférés sur une membrane synthétique via des méthodes de transfert sec, semi-sec ou humide. Dans le champ électrique généré par une alimentation, les protéines enrobées de SDS chargé négativement migrent vers l'électrode positive. Lorsque les protéines migrent hors du gel, elles sont capturées sur une membrane. La liaison des protéines à la membrane est un mécanisme irréversible. Les membranes peuvent être du type nitrocellulose, difluorure de polyvinylidène (PVDF) ou nylon. La membrane peut ensuite être bloquée avec de l'albumine sérique ou une solution de lait pour empêcher la liaison d'anticorps non spécifiques. Ceci est suivi d'un sondage avec des anticorps spécifiques de la protéine étudiée sur la membrane, une méthode similaire à l'immunohistochimie, mais sans besoin de fixation. Cette technique exploite la spécificité inhérente à la reconnaissance antigène-anticorps. La détection est généralement effectuée en utilisant des anticorps secondaires liés au chromogène ou au peroxyde pour catalyser une réaction chromogène ou chimioluminescente.

Applications de l'immunotransfert

Le Western blot est une méthode de biologie moléculaire de routine qui peut être utilisée pour comparer de manière semi-quantitative les niveaux de protéines entre les extraits. La séparation par taille, avant le transfert, permet d'évaluer le poids moléculaire de la protéine, par rapport aux marqueurs de poids moléculaire connus. Les immunotransferts sont le plus souvent utilisés dans le cadre de la recherche et sont généralement effectués pour confirmer les résultats de l'ELISA ou d'autres tests immunologiques. Dans les paramètres de diagnostic clinique, l'immunoélectrophorèse est appliquée, qui implique l'électrophorèse du sérum ou de l'urine suivie d'une immunodiffusion. La taille et la position des bandes de précipitation fournissent le même type d'informations sur la quantité d'anticorps que la méthode de double immunodiffusion.


Une introduction au western blot

Le Western blot vise à identifier des protéines spécifiques au sein d'un mélange complexe. La technique de western blot nécessite que les échantillons soient résolus en fonction de la taille par électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS PAGE), après quoi ils sont transférés et immobilisés sur une membrane avant la détection à base d'anticorps.

Étiquetage indirect et direct Western blot

Avant d'exécuter un western blot, il est extrêmement important de rechercher minutieusement la protéine cible. Pour en savoir plus sur la procédure, reportez-vous à notre protocole western blot.

  1. Dans un western blot traditionnel (marquage indirect), les échantillons de protéines sont d'abord résolus par SDS PAGE puis transférés par électrophorèse sur la membrane.
  2. Après une étape de blocage, la membrane est sondée avec un anticorps primaire qui a été dirigé contre l'antigène en question.
  3. Après une étape de lavage, la membrane est généralement incubée avec un colorant ou un anticorps secondaire conjugué à une enzyme qui est dirigé contre l'anticorps primaire.
  4. La fluorescence du colorant ou l'activité de l'enzyme, telle que la phosphatase alcaline (AP), la glucose oxydase (GO) ou la peroxydase de raifort (HRP), est nécessaire à la génération du signal.
  5. Enfin, la membrane est à nouveau lavée et incubée avec un substrat enzymatique approprié (si nécessaire), produisant un signal signalable.
  6. Dans l'analyse de marquage direct, la nécessité de l'étape d'anticorps secondaire est éliminée, simplifiant ainsi la procédure, raccourcissant le protocole et accélérant le délai d'obtention des résultats.

Vous pouvez regarder notre webinaire western blot à la demande pour plus d'informations sur la procédure de western blot.

Détection par immunoempreinte

Il existe plusieurs choix de lecture lors du Western Blot. Chacun présente des avantages et des inconvénients, qui dépendent de vos besoins et de l'équipement disponible dans votre laboratoire.

Western blot colorimétrique

Figure 1 . Représentation schématique de la détection colorimétrique par western blot. Le panneau de gauche montre la détection indirecte tandis que le panneau de droite montre la détection directe.

La détection colorimétrique repose sur la génération d'un produit coloré qui se dépose sur le western blot, qui se forme suite à la conversion d'un substrat de buvardage chromogène par une enzyme appropriée. La sensibilité limitée des substrats chromogènes peut rendre difficile leur optimisation pour la détection de protéines de faible abondance, bien que la réaction chromogène puisse se développer pendant plusieurs heures (voire une nuit) pour permettre au signal de fond de se développer simultanément.

Cependant, les substrats colorimétriques sont parfaits pour la détection de protéines abondantes puisque la réaction peut être surveillée visuellement et laissée progresser jusqu'à ce qu'il y ait un développement de couleur adéquat avant d'être arrêtée. Aucun équipement spécialisé n'est requis pour la visualisation du précipité coloré, et le signal produit est très stable.

Western blot fluorométrique

Figure 2. Représentation schématique de la détection par transfert western fluorescent. ​​

La détection fluorométrique nécessite l'utilisation d'un anticorps qui a été marqué avec un fluorophore. Une source lumineuse est utilisée pour exciter le fluorophore, qui produit alors une émission lumineuse transitoire lorsqu'il revient à son état fondamental. La lumière est émise à une longueur d'onde plus élevée que celle qui a été utilisée pour l'excitation et est détectée avec un lecteur spécialisé.

Western blot chimiluminescent

​​ ​ Figure 3. Représentation schématique de la détection par transfert western chimiluminescent.

La chimiluminescence se produit lorsqu'un substrat est catalysé par une enzyme et produit de la lumière en tant que sous-produit de la réaction. Le réactif limitant de la réaction est le substrat - à mesure qu'il est épuisé, la production de lumière diminue et finit par s'arrêter. Cependant, une procédure bien optimisée devrait produire un flux lumineux stable pendant plusieurs heures, permettant une détection cohérente et sensible des protéines.


Différents types d'électrophorèse sur gel pour les protéines

On peut choisir parmi différents types d'électrophorèse sur gel pour les protéines en fonction des critères selon lesquels les protéines doivent être séparées. Certaines méthodes électrophorétiques couramment utilisées sont : SDS-PAGE, native-PAGE et focalisation isoélectrique.

PAGE FDS :

Il s'agit d'une méthode dénaturante car elle traite les protéines avec un détergent anionique SDS (sodiumdodcylsulfate). Les structures secondaires et tertiaires sont détruites par ce processus. De plus, le SDS lie les protéines et couvre ainsi leurs charges chimiques, conduisant à des protéines également chargées négativement. Par conséquent, la séparation suivante se produit uniquement par la taille des chaînes polypeptidiques dans le gel de polyacrylamide.

Tampon et kits SDS-PAGE recommandés

PAGE native :

Les protéines natives, dépliées et non dénaturées peuvent être séparées en utilisant cette méthode. Cette méthode permet de séparer des protéines inaccessibles par d'autres méthodes. Un exemple serait la séparation de protéines modifiées et non modifiées du même type (par exemple, état phosphorylé versus état non phosphorylé d'une protéine). La PAGE native peut également être utilisée pour confirmer des conformations biologiquement pertinentes, comme les formes di-, tri- ou tétramères de protéines (contrairement à la SDS-PAGE, qui séparerait les chaînes peptidiques individuelles et dénaturées). Cette méthode permet également de détecter différents complexes de différentes protéines.

La séparation à l'aide de la PAGE native dépend d'un certain nombre de paramètres tels que la charger, Taille et Structure 3D de la protéine. Un tampon approprié est nécessaire pour maintenir le repliement 3D de la protéine. L'applicabilité du tampon dépend du point isoélectrique et des charges de la protéine.

Focalisation isoélectrique :

Cette méthode repose sur le fait qu'une protéine a une charge spécifique à certaines valeurs de pH. Selon le pH, les groupes fonctionnels acides et basiques contribuent en augmentant ou en diminuant la charge totale de la protéine. Le point isoélectrique est défini comme le point où la charge totale de la molécule est nulle, car il y a une quantité égale de charges négatives et positives dans la molécule.

Des gels à gradient spéciaux sont nécessaires pour la focalisation isoélectrique lorsque le pH passe d'acide à basique le long d'un gradient à l'intérieur du gel. En raison d'une charge électrique connectée au gel, la protéine se déplace jusqu'au point du gel où la charge du gel est égale à celle de la protéine et la charge totale est égale à zéro, c'est-à-dire le point isoélectrique. Par conséquent, cette méthode est utilisée pour séparer les protéines par leurs charges, ainsi que pour déterminer le point isoélectrique d'une protéine cible. La séparation se produit en raison de la charge de la protéine ou du nombre de groupes basiques et acides que la protéine contient.

Les procédés mentionnés ci-dessus pour l'électrophorèse sur gel de protéines peuvent également être combinés pour séparer les protéines. Le choix des méthodes dépend des exigences spécifiques de l'expérience.


Western blot (immunoblot)

Dans la procédure d'aujourd'hui, vous sonderez vos blots avec des anticorps contre le « tag » GFP sur vos protéines de fusion, cela révélera finalement une bande de protéine dont le poids moléculaire (MW) est une combinaison du MW de la protéine GFP (

26 kDa) plus celle du produit protéique de votre gène. Cette valeur peut être déterminée en comptant les nucléotides dans les régions « grise » et « verte » de votre diagramme de gènes à code couleur. Commencez le « compte de mots » avec le premier nucléotide grisé et comptez toute la zone à travers et y compris le codon TAA « stop » rouge à la fin de la région GFP « verte ». Divisez ce nombre par trois pour obtenir le nombre de codons (qui est le nombre d'acides aminés codés), multipliez-le par 110* pour obtenir le PM approximatif (en daltons) de votre protéine de fusion. Par exemple, 1500 nucléotides signifie 500 codons et donc 500 acides aminés 500 x 110 = 55 000 daltons (ou 55 kilodaltons, kDa).

* Le poids moléculaire moyen d'un acide aminé est de 110 daltons

Vue d'ensemble d'une procédure d'immunotransfert typique :

Une protéine unique spécifique sur un gel peut être visualisée par analyse immunoblot avec un anticorps qui reconnaît la protéine d'intérêt. Pour effectuer un immunoblot, les protéines séparées dans le gel sont d'abord transférées sur une membrane (généralement de la nitrocellulose ou du PVDF) qui peut être traitée avec des solutions d'anticorps. Après incubation préliminaire de la membrane dans un excès de protéine « inerte » (par exemple, du lait) pour bloquer les réactions de liaison aux protéines non spécifiques, la membrane est ensuite incubée avec un anticorps primaire, qui est un anticorps généré pour reconnaître spécifiquement la « protéine de l'intérêt'. Pour nos besoins, cette protéine cible est la GFP, le « tag C-terminal » commun à toutes les protéines de fusion. L'excès d'anticorps primaire est éliminé après une brève période d'incubation, puis le transfert est « lavé » avec du tampon pour éliminer les anticorps non spécifiquement ou faiblement liés.

Après cela, un anticorps secondaire qui reconnaît le premier anticorps (primaire) est incubé sur le transfert. Cet anticorps secondaire, qui est dirigé contre des anticorps d'une espèce spécifique (par exemple, des anticorps anti-souris ou des anticorps anti-lapin) est lié de manière covalente à une enzyme (généralement la peroxydase de raifort, HRP) qui catalyse une réaction génératrice de lumière localisée en présence de substrat. C'est ce qu'on appelle la détection chimiluminescente (utilisant des réactions chimiques pour générer de la lumière) et les photons émis sont capturés à l'aide de la caméra CCD de l'unité d'imagerie BioChemi. Le mélange de substrats chimiluminescents pour HRP se compose de tampons de peroxyde et d'une variante exclusive de luminol conçue pour générer de la lumière à partir de très petites quantités de protéines.

En fin de compte, cela produit une image de votre tache avec des bandes lumineuses «blanches» sur un fond noir. L'image peut être « inversée » pour plus de clarté, et ces images le sont généralement avant la présentation dans un rapport ou une publication.

Les anticorps comme outils de détection de protéines :

Parmi toutes les protéines extraites des cellules tumorales transfectées et résolues à l'étape d'électrophorèse, le western blot permet la détection d'une seule protéine, ou plus précisément, un seul domaine protéique ou épitope, sur le blot. Pour la détection de vos protéines de fusion GFP, nous utilisons un anticorps qui se lie spécifiquement à la GFP et devrait donc détecter chaque protéine de fusion quel que soit le « partenaire de fusion ».

Dans un immunoblot occidental, l'anticorps primaire peut être « monoclonal » ou « polyclonal », et le choix fait par l'utilisateur est généralement basé sur l'anticorps le plus efficace disponible pour la protéine donnée et/ou les informations spécifiques nécessaires. Un anticorps monoclonal est dérivé d'un seul clone des cellules « B » productrices d'anticorps d'une souris ou d'un rat immunisé2. Toutes les molécules d'anticorps (Ab) dans ces préparations ont une spécificité identique en ce sens qu'elles reconnaissent le même épitope3 sur la protéine cible. En revanche, une préparation d'anticorps polyclonaux est une combinaison des produits d'anticorps de plusieurs clones de cellules « B », qui sont généralement dérivés des sérums de lapins, de chèvres ou de moutons immunisés, et ils reconnaissent collectivement plusieurs épitopes (régions) sur la protéine cible. . Que vous utilisiez un anticorps monoclonal ou polyclonal comme anticorps primaire dans un western blot dépend d'un certain nombre de facteurs -disponibilité, efficacité, coût- mais surtout de savoir si vous avez besoin de la spécificité précise qu'un Ab monoclonal fournit (en se liant à seulement un région très spécifique de la protéine) ou s'il suffirait de reconnaître une région "plus grande", auquel cas un Ab polyclonal fonctionnerait très bien. Notre anticorps contre la GFP (anti-tGFP) se trouve être un anticorps monoclonal de souris, acheté via Origene.

L'anticorps secondaire (un « anti-anticorps ») dans un protocole de transfert western est, par définition, isolé d'une espèce autre que l'espèce qui a produit votre anticorps primaire. Cet anticorps (généralement polyclonal) se liera à plusieurs déterminants communs (c'est-à-dire des épitopes) sur les anticorps de l'espèce qui a généré l'anticorps primaire. L'anticorps secondaire peut être appelé anticorps « anti-souris de lapin » (dérivé d'anticorps de lapin contre anticorps de souris), anticorps « anti-lapin de chèvre » (dérivé d'anticorps de chèvre contre anticorps de lapin), « anticorps de mouton anti-lapin » (dérivé d'anticorps de mouton contre des anticorps de lapin), etc. Notre anticorps secondaire à utiliser dans la détection de GFP est un anticorps de chèvre anti-souris lié à la HRP, ou « GAM-HRP », acheté auprès de Pierce.

Protocole d'immunotransfert - ajout d'anticorps primaire :

Deux heures avant le laboratoire, vous viendrez au laboratoire très brièvement pour ajouter un anticorps primaire à vos taches bloquées. N'oubliez pas de garder une trace de quelle équipe est sur quelle « moitié » de tache.

  1. Tout d'abord, versez (dans l'évier) la solution de blocage du PVDF blot.
  2. A chaque plateau, ajoutez

*La solution d'anticorps primaire se compose de : un anticorps monoclonal de souris (mAb) qui reconnaît le tGFP , dilué à 1:2000 4 dans 1X TBST avec 0,5 % de lait. (Clone 2H8, cat# TA 150041, d'OriGene Technologies Inc.)

    Fermez le plateau et placez-le sur la bascule à l'arrière du 406. Les blots seront incubés dans une solution d'anticorps primaire à température ambiante pendant

Lavage, incubation secondaire des anticorps et développement :

300 ml de 1X TBST (pas de lait), préparé à partir du concentré 2X, à des fins de lavage si nécessaire, il peut être préparé rapidement. Les restes 1X peuvent être conservés.

A la fin de la période d'incubation de 10 anticorps,

  1. Vider et jeter l'anticorps primaire, en prenant soin de soutenir la membrane PVDF avec un ou plusieurs doigts gantés.
  2. Rincez la tache deux fois pendant quelques secondes chacune, avec suffisamment de 1X TBST pour couvrir la tache, en versant chaque rinçage dans l'évier.
  3. Effectuez trois lavages ultérieurs de la tache, chacun avec suffisamment de TBST 1X pour couvrir les taches (plus de 10 ml, mais pas au point de déborder du plateau). Laver en basculant le blot immergé dans son bac fermé, sur la plateforme basculante comme suit :

• 10 minutes5 (puis jetez le linge dans l'évier)

• 5 minutes (jeter la solution de lavage comme ci-dessus)

• 5 minutes (ne pas jeter immédiatement, voir l'étape 4 ci-dessous)

  1. Pendant le lavage final (ou avant), 10 ml de solution d'anticorps secondaire doivent être préparés pour chaque transfert (Chèvre Anti-Mouse, HRP-conjugué). Le GAM-HRP aura été dilué (par l'instructeur) à 1:10 000 (un «sous-stock») dans le même tampon que l'anticorps primaire (1X TBST / 0,5% de lait) dont vous avez besoin pour diluer davantage ce sous-stock de 1:5, pour une dilution finale de 1:50 000 . Pour ce faire, il suffit d'ajouter 2 ml de sous-stock GAM-HRP à 8 ml de lait 1X TBST/0,5 % (fourni) dans un tube de 15 ml. Mélanger en retournant quelques fois.
  2. Jetez la solution de lavage finale de l'étape 3, ajoutez les 10 ml entiers de la solution GAM-HRP préparée à l'étape 4. (Ne laissez PAS la tache sécher !)
  3. Incuber sur la plateforme basculante en 406 pendant

La taille des protéines peut être estimée par comparaison avec des étalons de poids moléculaire connus qui sont exécutés à côté des échantillons expérimentaux. Nous avons utilisé le « Kaleidoscope » de BioRad comme étalon de poids moléculaire (voir pdf en Bb pour l'image étiquetée). Il s'agit de protéines pré-colorées recombinantes conçues pour fournir une échelle très précise de tailles pratiques. [Une courbe standard générée en traçant le log de leurs poids moléculaires en fonction de la distance de migration (Rf) dans un gel SDS-PAGE révèle une ligne droite avec r2 = 0,996.]


Aperçu

Détection par Western Blot des événements de phosphorylation ​

Détection Western Blot de lysats tissulaires ​

Éclairer la voie vers une détection fiable par Western Blot des protéines phosphorylées

Le Western blot, également connu sous le nom d'immunoblotting ou de protein blot, est une technique de base en biologie cellulaire et moléculaire. En termes les plus élémentaires, il est utilisé pour détecter la présence d'une protéine spécifique dans un mélange complexe extrait de cellules ou de tissus.

Notre guide d'introduction au western blot fournit des informations détaillées, étape par étape, sur cette technique omniprésente. Notre Western Blot Doctor&trade est également disponible, un guide d'auto-assistance pour identifier et résoudre les problèmes de Western Blot.

Le multiplexage par western blot fluorescent permet de détecter et de quantifier plusieurs protéines dans un seul échantillon avec des anticorps fluorescents hautement spécifiques et sensibles. Permettant ainsi des comparaisons directes d'abondance de protéines et une normalisation par rapport à un contrôle, par exemple un gène domestique, ce qui est plus précis, plus facile et permet de gagner du temps car vous n'aurez plus à décaper et à re-sonder. Il préserve également votre précieux échantillon.

Découvrez comment les anticorps secondaires Bio-Rad StarBright&trade Blue 700 et le système d'imagerie MP ChemiDoc&trade peuvent vous aider dans votre multiplexage fluorescent.


Une méthode non enzymatique pour la dissection du tissu urothélial de la vessie de souris

Les cellules urothéliales contribuent aux fonctions de la vessie, y compris le stockage de l'urine, la vidange de l'urine et la réponse immunitaire innée. Les études fonctionnelles des cellules urothéliales utilisent généralement soit des cellules fraîchement isolées, soit des cellules cultivées. La plupart des méthodes d'isolement des cellules urothéliales nécessitent des enzymes. Cependant, ces techniques éliminent les protéines qui relient les cellules et perturbent l'orientation des cellules dans l'urothélium multicouche. De plus, les résultats de PCR ou d'immunotransfert obtenus à partir d'homogénats de muqueuse vésicale ou de vessie entière ne représentent pas des cellules urothéliales pures. Nous décrivons un processus de dissection qui ne nécessite pas d'enzymes et est capable d'obtenir des tissus urothéliaux purs de souris et d'humains. Cette méthode peut isoler des cellules urothéliales uniques pour l'électrophysiologie in situ et peut également isoler du tissu urothélial pur pour les procédures de PCR, de microarray et d'immunotransfert. Le temps nécessaire pour obtenir du tissu urothélial à partir d'une vessie de souris est de 15 à 20 min. Cette méthode est simple et rapide par rapport aux méthodes alternatives et facilite donc notre compréhension de la biologie urothéliale.


Procédure

Les procédures de transfert Western comprennent les étapes suivantes :

Préparation des tissus (préparation de l'échantillon de lysat):

Prélevez l'échantillon, ajoutez du PBS glacé et un tampon de lyse tel que le tampon RIPA qui est un tampon couramment utilisé pour un rendement maximal en protéines. (Le choix du tampon de lyse dépend largement de la localisation de la protéine d'intérêt, la solubilisation des protéines liées à la membrane nécessite des détergents d'extraction plus puissants que les protéines cytoplasmiques isolées).

Utilisez toujours des inhibiteurs de protéase fraîchement préparés, conservez les échantillons sur de la glace et travaillez rapidement.

Le tampon de lyse doit contenir des inhibiteurs de protéase pour empêcher la dégradation de la protéine d'intérêt. Les cellules sont lysées en incubant sur de la glace puis en appliquant une pression de cisaillement à l'aide d'une pipette. Le mélange cellulaire est centrifugé et le culot est jeté. Le surnageant est le lysat que nous utiliserons pour un traitement ultérieur.

  • le bêta-mercaptoéthanol, ou DTT, pour réduire les crêtes disulfures entre les cystéines,
  • SDS pour aider à la dénaturation et fournir une charge négative nette à la protéine,
  • du glycérol pour permettre aux échantillons de couler dans chaque puits,
  • bleu de bromophénol pour visualiser le lysat et un tampon ionique.

Vortexer chaque échantillon et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénaturer complètement les protéines. L'échantillon est maintenant prêt à être chargé dans un gel de page SDS.

Électrophorèse sur gel :

Dans cette étape, nous séparerons les protéines individuelles dans notre échantillon de lysat en fonction de leur poids moléculaire en utilisant une électrode positive pour attirer une protéine chargée négativement. Pour ce faire, nous chargeons nos échantillons de protéines préalablement préparés dans un gel de polyacrylamide disponible dans le commerce.

  1. Préparez votre gel en l'insérant dans l'appareil d'électrophorèse et en le remplissant avec un tampon de fonctionnement approprié à la chimie de votre gel. Rincez les puits du gel avec un tampon de fonctionnement et ajoutez du tampon dans les chambres.
  2. Chargez vos échantillons dans les puits et charger une échelle de poids moléculaire pré-colorée dans un puits. L'échelle vous permettra de surveiller la séparation des protéines pendant l'électrophorèse et de vérifier par la suite le poids des protéines dans votre échantillon lors d'une analyse ultérieure.
  3. Fermez l'unité d'électrophorèse et connectez-la à une alimentation électrique. La plupart des unités fonctionnent généralement de 45 à 60 minutes à 200 volts ou jusqu'à ce que le tampon de charge atteigne le fond du gel. Pendant ce temps, les protéines chargées négativement dans chaque échantillon migreront vers l'électrode chargée positivement en se frayant un chemin à travers la matrice de gel de polyacrylamide.

Transfert

Dans cette prochaine étape, nous transférerons les protéines séparées du gel dans une membrane solide ou un transfert. Ceci est basé sur le même principe que l'étape précédente dans laquelle un champ électrique est chargé pour déplacer les protéines négatives vers une électrode positive. Le transfert peut se produire dans des conditions humides ou semi-sèches.

  • Commencez par retirer le gel de sa cassette en coupant la partie supérieure contenant les puits.
  • Encochez le coin supérieur gauche pour indiquer l'orientation du gel.
  • Faire flotter le gel dans le tampon de transfert pendant la préparation du sandwich de transfert. Pour réaliser le sandwich de transfert, il faut une cassette, des éponges, du papier filtre, le gel et du papier membrane PVDF ou nitrocellulosique.
  • Encochez le coin supérieur gauche du papier buvard pour indiquer l'orientation du transfert et incubez les membranes dans le tampon de transfert pendant 10 minutes.
  • Créez une pile en plaçant les composants suivants de la cathode négative noire à l'anode positive rouge :éponge, papier filtre, gel, membrane, papier filtre et éponge (Veillez à ne pas toucher le gel ou la membrane à mains nues et utilisez plutôt une pince à épiler ou une spatule propres. Toucher la membrane pendant n'importe quelle phase peut contaminer la tache et entraîner un signal de fond excessif).
  • Utilisez un rouleau propre avec chaque couche pour dérouler doucement les bulles qui peuvent être présentes car les bulles empêcheront le transfert efficace des protéines.
  • Verrouillez la cassette et placez-la dans l'appareil de transfert contenant un tampon de transfert froid en vous assurant que la cassette est correctement positionnée du négatif au positif.Afin d'éviter l'accumulation de chaleur, il est avantageux de transférer avec une compresse froide dans l'appareil ou dans une chambre froide avec la barre de rotation placée au fond de la chambre.
  • Fermez la chambre et connectez-vous à une alimentation électrique.
  • Effectuez le transfert selon les instructions du fabricant qui est normalement de 100 volts pendant une troisième à 120 minutes.

Immunoblot

Comme étape facultative, nous pouvons vérifier que les protéines ont été transférées avec succès en colorant la membrane avec du rouge ponceau. Incuber la membrane dans du ponceau pendant cinq minutes et laver à l'eau jusqu'à ce que les bandes soient claires. Après vérification, la tache peut ensuite être décolorée en continuant à laver avec de l'eau ou du TBS tween jusqu'à ce que le colorant soit complètement éliminé.

Une étape facultative recommandée consiste également à utiliser un anticorps de contrôle de chargement positif qui permet à l'utilisateur de vérifier que des quantités égales de protéines totales ont été chargées dans chaque puits et facilite le dépannage en supprimant toute incertitude avec la procédure Western Blot.

Détection

Dans cette phase finale, nous démontrerons le développement du signal en utilisant la méthode de détection la plus courante, la plus sensible et la moins coûteuse, l'électrochimiluminescence ou la réaction ECL. Cette méthode utilise l'enzyme HRP qui a été conjuguée au secondaire pour catalyser la réaction ECL et produire de la lumière. Une lumière est ensuite recueillie sur un film radiographique et développée ou numérisée à l'aide d'une caméra spécialisée suffisamment sensible pour cette application.

Pas:

  • Nous commençons par mélanger des parties égales de réactifs ECL dans un rapport de un pour un selon les instructions du fabricant.
  • Nous allons incuber la membrane pendant 3 à 5 minutes sans agitation.
  • Après incubation, décanter le mélange ECL et utiliser une lingette de laboratoire pour essuyer l'excès de solution du coin de la membrane.
  • Placez la membrane dans une pellicule de plastique transparente telle qu'une feuille de protection pour éviter le dessèchement.
  • Nous pouvons maintenant utiliser un rouleau pour faire sortir les bulles ou tout excès de solution.
  • Développer immédiatement la membrane.
  • Les systèmes de film et de caméra nous permettent d'ajuster manuellement le temps d'exposition afin de assurer un Western Blot parfait. Les densités de bandes relatives peuvent maintenant être quantifiées avec un logiciel disponible dans le commerce. Le poids moléculaire approprié peut également être vérifié en comparant les tailles de bande à l'échelle de poids moléculaire.

Identification des organismes génétiquement modifiés

29.4.1 Western Blot

Le Western blot est une méthode hautement spécifique qui fournit des résultats qualitatifs permettant de déterminer si un échantillon contient la protéine cible en dessous ou au-dessus d'un niveau seuil prédéterminé ( Lipton et al., 2000), et est particulièrement utile pour l'analyse des protéines insolubles ( Brett et al., 1999 ). De plus, comme la séparation électrophorétique des protéines est effectuée dans des conditions dénaturantes, tous les problèmes de solubilisation, d'agrégation et de coprécipitation de la protéine cible avec des protéines adventices sont éliminés (Rogan et al., 1999 Sambrook et Russel, 2000 ). Les limites de détection des Western blots varient entre 0,25% pour les graines et 1% pour la farine grillée ( Smyth et al., 2002 ). Cette méthode, même si elle peut fournir des résultats quantitatifs et est sensible, est considérée comme plus adaptée aux applications de recherche qu'aux tests de routine car elle ne se prête pas à l'automatisation. Le transfert Western prend généralement environ deux jours et coûte environ 150 $/échantillon (Ahmed, 2002).


7. Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une autre technique populaire à utiliser en biotechnologie. La cytométrie en flux est une technique basée sur le laser ou l'impédance utilisée dans le comptage cellulaire, le tri cellulaire, la détection de biomarqueurs et l'ingénierie des protéines, en suspendant les cellules dans un flux de fluide et en les faisant passer à travers un appareil de détection électronique.

La cytométrie en flux permet d'étudier l'expression de la surface cellulaire et des molécules intracellulaires, en caractérisant et en définissant différents types de cellules dans une population cellulaire hétérogène. Il aide ainsi à évaluer la pureté des sous-populations isolées et à analyser la taille et le volume des cellules. Il permet également une analyse multi-paramètres simultanée de cellules individuelles. La cytométrie en flux est l'étalon-or actuel pour identifier les types de cellules au sein d'une population mixte.

La technologie a été largement utilisée dans le diagnostic des problèmes de santé, en particulier des maladies du sang telles que la leucémie, bien qu'elle soit également couramment utilisée dans les différents domaines de la biologie moléculaire, de l'immunologie, de la pathologie, des sciences marines et de la biologie végétale. En médecine, la cytométrie en flux est un processus de laboratoire essentiel utilisé en transplantation, en oncologie, en hématologie, en génétique et en diagnostic prénatal. En savoir plus sur le processus de flux de cytométrie en flux.


12.2J : Procédures d'immunotransfert - Biologie

Pour détecter l'antigène transféré sur la membrane, un anticorps primaire (sérum) est ajouté à une dilution appropriée et incubé avec la membrane. S'il y a des anticorps présents qui sont dirigés contre un ou plusieurs des antigènes transférés, ces anticorps se lieront à la ou aux protéines tandis que d'autres anticorps seront éliminés à la fin de l'incubation. Afin de détecter les anticorps qui se sont fixés, des anticorps anti-immunoglobuline couplés à un groupe rapporteur tel que l'enzyme phosphatase alcaline sont ajoutés (par exemple, l'anti-IgG humaine de chèvre-phosphatase alcaline de chèvre). Cette enzyme anti-Ig est communément appelée "second anticorps" ou "conjugué". Enfin, une fois que le deuxième anticorps en excès est lavé du transfert, un substrat est ajouté qui précipitera lors de la réaction avec le conjugué résultant en une bande visible où l'anticorps primaire se lie à la protéine.

Pour ce test de diagnostic spécifique, les cellules infectées par le VIH sont lysées, soumises à une SDS-PAGE et transférées sur une membrane comme décrit ci-dessus. La membrane a été bloquée, coupée en bandes et incubée avec les échantillons de sérum de chaque patient comme indiqué.

La page suivante montrera un exemple de Western blot et comment l'interpréter.


Voir la vidéo: Détection des protéines spécifiques par WESTERN BLOT: Principe et Protocole. Biochimie Facile (Janvier 2022).