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Dois-je diluer en série les cultures d'E. coli pour les mesures de densité optique ?


Je suis censé suivre la croissance cellulaire en mesurant la concentration cellulaire de la culture en incubation toutes les 30 minutes environ. Mes questions sont donc : Pourquoi dois-je faire une dilution en série (en supposant que je le fasse) ? Pourquoi ne puis-je pas simplement remplir une cuvette avec le volume de culture d'incubation de la cuvette et mesurer cela par rapport au blanc toutes les 30 minutes ? Et si j'ai besoin de diluer, jusqu'où dois-je diluer (1:100, 1:1000, etc.) ? Ceci est pour une culture remplie d'E. coli.


Il n'est normalement pas nécessaire de diluer en série E. coli cultures pour les mesures spectrophotométriques, au moins dans les expériences où la valeur de DO est importante.

Pour la plupart des travaux d'expression de protéines, le consensus est de commencer l'induction à une DO 0,6, et pour la plupart des cellules chimiquement compétentes, la DO optimale varie de 0,3 à 0,8 selon le protocole de compétence. À aucun moment, vous n'avez besoin d'effectuer des dilutions, car elles se situent toutes dans la plage linéaire du rapport nombre de cellules:OD.

Le seul moment où vous avez besoin de diluer la culture est lorsque vous voulez trouver la DO d'une culture très concentrée (par exemple après 24 heures d'incubation vigoureusement agitée).


La lecture de la densité optique d'une culture microbienne en phase logarithmique à une longueur d'onde fixe se rapproche de la loi de Beer-Lambert où A = ecl. Cette relation n'est pas linéaire car l'absorbance s'approche de 1,0, donc à des densités cellulaires plus élevées, vous finirez par sous-estimer la densité cellulaire de la culture. De même, la loi n'est pas précise en dessous d'une absorbance inférieure à ~ 0,05, donc une dilution de 10 fois devrait convenir. Finalement, la croissance de la culture va ralentir.


Vous devez diluer (pas nécessairement diluer en série) si :

  • Vous dépassez la plage de concentration détectable par la machine
  • La diffusion commence une absorption écrasante (à des densités cellulaires élevées, la diffusion écrasera l'absorbance). Dans de tels cas, vous pouvez utiliser un turbidimètre.

En tant que tel, il n'est pas question que la loi ne s'applique pas à certaines limites d'absorbance.

Donc, une règle générale pour la dilution des cellules est que la suspension ne doit pas avoir l'air très trouble (vous devriez pouvoir voir votre pouce de l'autre côté du tube à essai ;-) ).


Cela dépend de votre objectif, mais vous pouvez ensemencer des cellules dans une plaque multipuits et laisser le lecteur de microplaque surveiller la croissance. Certains lecteurs de microplaques peuvent incuber les cellules à une température que vous définissez, secouer la plaque et surveiller la DO.


Méthodes de validation essentielles pour E. coli souches créées par génie chromosomique

L'ingénierie chromosomique englobe un ensemble de techniques basées sur la recombinaison homologue qui sont utilisées pour modifier le génome d'un organisme modèle de manière contrôlée. De telles techniques sont largement utilisées dans la recherche fondamentale et industrielle pour introduire de multiples insertions dans le même Escherichia coli souche. À ce jour, la recombinaison λ-Red (également connue sous le nom de recombineering) et la transduction du phage P1 sont les techniques d'ingénierie chromosomique les plus efficacement mises en œuvre dans E. coli. Cependant, en raison des erreurs qui peuvent se produire pendant le processus de création de la souche, des méthodes de validation fiables sont essentielles lors de l'altération du chromosome d'une souche.

Résultats et discussion

Les méthodes basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et l'analyse des séquences d'ADN sont des méthodes rapides et puissantes pour vérifier l'intégration réussie des séquences d'ADN dans un chromosome. Même si ces méthodes de vérification sont nécessaires, elles peuvent ne pas être suffisantes pour détecter toutes les erreurs, imposant l'exigence de méthodes de validation supplémentaires. Par exemple, comme des insertions étrangères peuvent se produire pendant le recombineering, nous mettons en évidence l'utilisation du Southern blot pour détecter leur présence. Ces mutations indésirables peuvent être éliminées par transduction de la région d'intérêt dans le chromosome de type sauvage à l'aide de phages P1. Cependant, ce faisant, il faut vérifier que le lysat P1 et les souches utilisées sont exempts de contamination par des phages tempérés, car ceux-ci peuvent se lysogéniser à l'intérieur d'une cellule sous la forme d'un grand plasmide. Ainsi, nous illustrons diverses méthodes pour sonder la contamination par les phages tempérés, y compris la gélose à stries croisées et les tests sur plaque Evans Blue-Uranine (EBU), ce dernier étant une technique nouvellement signalée à cette fin dans E. coli. Enfin, nous discutons des méthodologies de détection des défauts de croissance cellulaire et des caractéristiques de forme, qui devraient être utilisées comme contrôle supplémentaire.

Conclusion

Les techniques de validation simples mais cruciales discutées ici peuvent être utilisées pour vérifier de manière fiable toute modification chromosomique E. coli souches pour des erreurs telles que des insertions non spécifiques dans le chromosome, une contamination par des phages tempérés et des défauts de croissance et de forme cellulaire. Alors que des techniques telles que la PCR et la vérification de la séquence d'ADN doivent être effectuées de manière standard, nous illustrons la nécessité d'effectuer ces tests supplémentaires. Les techniques discutées sont hautement génériques et peuvent être facilement appliquées à tout type d'ingénierie chromosomique.


Mutations chromosomiques dans Escherichia coli qui améliorent la tolérance aux sous-produits non volatils du traitement à l'acide dilué de la bagasse de canne à sucre

Correspondance Aiqin Shi, Département de biochimie et de biologie moléculaire, Penn State College of Medicine, Hershey, PA 17033.

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Laboratoire clé de bioremédiation de la contamination des sols de la province du Zhejiang, Collège des sciences de l'environnement et des ressources, Université Zhejiang A & F, Hangzhou, Chine

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Penn State College of Medicine, Hershey, Pennsylvanie

Correspondance Aiqin Shi, Département de biochimie et de biologie moléculaire, Penn State College of Medicine, Hershey, PA 17033.

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

Laboratoire clé de bioremédiation de la contamination des sols de la province du Zhejiang, Collège des sciences de l'environnement et des ressources, Université Zhejiang A & F, Hangzhou, Chine

Département de microbiologie et de science cellulaire, Université de Floride, Gainesville, Floride

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Résumé

La biomasse lignocellulosique fournit des glucides non alimentaires intéressants pour la production d'éthanol, et le prétraitement à l'acide dilué est un processus indépendant de la biomasse pour accéder à ces glucides. Cependant, ce prétraitement libère également des inhibiteurs volatils et non volatils des micro-organismes en fermentation. Pour identifier des produits géniques uniques contribuant à la sensibilité/tolérance aux inhibiteurs non volatils, éthanologènes Escherichia coli La souche LY180 a été adaptée pour la croissance dans l'hydrolysat acide de bagasse de canne à sucre traité sous vide (VBHz) dépourvu de furfural et d'autres inhibiteurs volatils. Un mutant, la souche AQ15, obtenu après environ 500 générations de croissance en VBHz, a fait croître et fermenter les sucres dans un milieu à 50% VBHz. L'analyse comparative de la séquence du génome des souches AQ15 et LY180 a révélé 95 mutations dans la souche AQ15. Six de ces mutations ont également été trouvées dans la souche SL112, un dérivé indépendant tolérant aux inhibiteurs de la souche LY180. Parmi ces six mutations, des mutations nulles dans mdh et bacA ont été identifiés comme des facteurs contribuant à la tolérance VBHz dans la souche AQ15, sur la base de l'analyse génétique et physiologique. La délétion de l'un ou l'autre gène dans la souche LY180 a augmenté la tolérance à VBHz d'environ 30 à 50 % (vol/vol). Compte tenu de la localisation et du rôle physiologique des deux enzymes dans la cellule, il est probable que les deux enzymes contribuent à la sensibilité VBHz des éthanologènes E. coli par différents mécanismes.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant à l'article.


Résultats

Mesure du mouvement chimiotactique à densité cellulaire variable

Pour mesurer à la fois la dynamique collective et la réponse chimiotactique des populations de E. coli cellules à densité variable, nous avons analysé la nage bactérienne dans des gradients contrôlés d'un attractif chimique à l'aide d'une configuration microfluidique, de la vidéomicroscopie et de l'analyse d'images de Fourier. Des dispositifs microfabriqués en polymère poly-diméthylsiloxane (PDMS) perméable à l'oxygène ont été utilisés comme décrit précédemment 49 pour créer des gradients linéaires quasi-statiques de l'attractif non métabolisable (alpha)-méthyl-D,L-acide aspartique ( MeAsp) dans un canal droit (Fig. 1a). Ce gradient pourrait être imité en utilisant le colorant fluorescent fluorescéine (Fig. 1b), qui a un coefficient de diffusion similaire à celui de MeAsp ( (Dsimeq 500 mu) m (<>^<2>) /s). Trois hauteurs de canaux, (h=50) , (30) et (8 mu) m, ont été utilisées pour confiner de plus en plus les suspensions cellulaires vers deux dimensions. Motilité des suspensions de E. coli Les bactéries, mesurées au milieu de ce gradient, ont été maintenues pendant plusieurs heures à toutes les densités cellulaires (Fig. 1a supplémentaire), en raison de la disponibilité de l'oxygène et de la source d'énergie abondante dans le milieu. Lorsque la densité a augmenté, le développement du mouvement collectif dans l'échantillon, caractérisé par l'existence de tourbillons collectifs et de jets de cellules nageuses a été observé (Fig. 2a) comme prévu 2,13,20. La forme du gradient, après la phase transitoire au cours de laquelle il s'établit, n'est en grande partie pas affectée par le mouvement collectif (Fig. 1c), sauf aux fractions de volume corporel des cellules bactériennes les plus élevées. Parallèlement, le nombre de Péclet, qui compare la diffusion et le transport advectif de MeAsp dans un tourbillon, reste modéré ( (Pe=h_<< m>>/Dle 1) , où (_<< m>>) est la vitesse du fluide voir note supplémentaire 1), confirmant que l'agitation par les bactéries a peu d'effet sur la diffusion de MeAsp 50 . De plus, dans la géométrie actuelle, à l'état stationnaire, la forme du gradient ne dépend pas du coefficient de diffusion. Étant donné que la densité cellulaire change lentement avec le temps dans la zone de mesure en raison de l'accumulation chimiotactique, différant ainsi de la densité cellulaire moyenne dans la suspension, la fraction volumique du corps cellulaire (_<< m>>) a été mesurée in situ pour chaque expérience (Fig. 2 complémentaire et « Méthodes »).

Dispositif microfluidique utilisé pour les tests de chimiotaxie. une Représentation schématique du dispositif, où deux réservoirs de composition chimique différente sont reliés par un canal dans lequel se forme le gradient de chimioattractant. b Partie centrale de l'appareil, surlignée en orange en (une), avec un profil de gradient à travers le canal quantifié à l'aide de fluorescéine. La barre d'échelle est de 500 (mu) m. La case rouge indique l'emplacement auquel le comportement cellulaire est enregistré. c Exemples de gradients, mesurés dans le dispositif (h=50 mu) m, pour des suspensions cellulaires de densités cellulaires indiquées. Les barres d'erreur représentent l'erreur de mesure.

Mouvement collectif dans les suspensions bactériennes. une Instantané typique du champ de vitesse mesuré dans une suspension cellulaire à haute densité ( (_<< m>>=0.08) , longueur de cellule (L=2 upmu) m, hauteur de canal (h=50 upmu) m). b Facteur de structure d'écoulement (E(q)) pour augmenter les densités de cellules aux valeurs indiquées de hauteur de canal et de longueur de cellule. c Amplitude du pic, corrigée de la valeur de faible densité, (Delta E(_<< m>>)) en fonction de la densité cellulaire dans les différentes conditions expérimentales. Chaque point est la médiane et l'erreur associée barre l'erreur standard de la moyenne (SEM) de 8 mesures, classées en fonction de la densité cellulaire. Encart : (pi /_<< m>>) en fonction de la hauteur du canal. La ligne pointillée indique l'égalité.

Pour étudier plus avant l'effet de l'élongation cellulaire, qui est généralement observée pour les bactéries essaimant sur un hydrogel humide à haute densité 4, nous avons comparé la taille normale E. coli avec une longueur moyenne de (L=2 mu) m et des cellules allongées à une moyenne de (L=4 mu) m lors d'un traitement par la céphalexine, un médicament empêchant la division cellulaire (« Méthodes » et Fig. 2). Nous avons observé que le traitement à la céphalexine augmente fortement l'auto-agrégation cellulaire, qui est médiée dans cette E. coli souche par l' adhésine Antigène 43 38 . Nous avons ensuite utilisé (Delta) grippe souche supprimée pour le gène codant pour cette adhésine pour tous les résultats rapportés dans cette étude, car, en l'absence de traitement à la céphalexine, grippe+ et (Delta) grippe les cellules se comportent de manière similaire, en ce qui concerne à la fois leur mouvement collectif et leur chimiotaxie (Fig. 3 supplémentaire), et le (Delta) allongé grippe les cellules montrent une motilité normale (Fig. 1 supplémentaire).

Structure du mouvement collectif

Le mouvement collectif a été mesuré dans le gradient à l'aide d'une méthode de vélocimétrie d'image dérivée de la microscopie différentielle de phase 49 (« Méthodes ») pour quantifier le champ de vitesse local (<f>(<f>)) , moyennée sur plusieurs bactéries voisines (Fig. 2a). La structure spatiale du champ d'écoulement à une fraction de volume cellulaire variable (_<< m>>) a été caractérisé par la densité spectrale de puissance bidimensionnelle du champ de vitesse (« Méthodes ») 20 :

avec (< ilde<f>>) la transformée de Fourier spatiale de (<f>) , (<f>) le vecteur d'onde et (_<0>) la zone du champ de vision. Cette quantité (E(q)) (Fig. 2b) mesure la distribution de l'énergie cinétique sur les tailles de structure d'écoulement (pi /q) , représentant ainsi la probabilité d'observer un « vortex » de taille ( pi /q) 20 . À (_<< m>>gtrsim 0.01) , ce facteur de structure d'écoulement présente, à un faible nombre d'onde (_) , un maximum (E(_)) , qui croît en amplitude à mesure que la fraction volumique cellulaire augmente (Fig. 2b). Après une diminution initiale, la valeur de (_) atteint un plateau (_<< m>>) à une fraction de volume cellulaire modérée, correspondant à (E(_)gtrsim 15 mu ) m (Fig. 4a supplémentaire). Le mouvement collectif pleinement développé prend ainsi la forme de structures d'écoulement (tourbillons) avec une taille spécifique, (pi /_<< m>>) . Une augmentation de la densité cellulaire entraîne une augmentation de la quantité de flux collectif de cette taille - l'amplitude du mouvement collectif, qui peut être quantifiée par (E(_<< m>>)) . De façon intéressante, (_<< m>>) est apparemment déterminé par la hauteur (h) du canal (fig. 2c encart et Fig. 4a supplémentaire), indiquant que les structures d'écoulement sont contraintes par la taille du système. La diminution observée de (_) à une fraction de volume cellulaire faible peut être due à une combinaison de (E(_)) atteignant le niveau de bruit, représenté par le (E(q) sans relief observé aux plus faibles fractions de volume cellulaire (Fig. 2b), et une véritable réduction de la taille des tourbillons lorsque (< Phi >_<< m>>) devient faible.

Pour simplifier, l'amplitude du mouvement collectif a été quantifiée par (Delta E(_<< m>>)) à toutes les fractions volumiques (Fig. 2c), c'est-à-dire (E(_<< m>>)) (Fig. supplémentaire 4b, c) corrigé du bruit de fond. Nous avons observé que (Delta E(_<< m>>)) a tendance à croître plus lentement avec la fraction volumique pour les suspensions plus confinées (plus faible (h) ). A confinement modéré ( (h=30) et (50 upmu) m), (Delta E(_<< m>>)) croît aussi plus lentement pour les cellules plus longues, alors que pour (h=8 mu) m c'est au contraire une seule fonction de (_<< m>>) pour les deux longueurs de cellule (Fig. 2c). Surtout, lorsqu'il est normalisé à sa valeur élevée (_<< m>>) , (Delta E(_<< m>>)) s'est avéré être pour toutes les conditions une fonction unique du flux de masse bactérienne intégrée sur la taille du vortex (_<< m>>_<0> pi /_<< m>>) , où (_<0>) est la vitesse de nage moyenne de la population des cellules (Fig. 4d). Pour (_<< m>> <,>lesssim <,>0.01) , (_<0>) lui-même est en moyenne constant à une valeur comprise entre (10) et (25 upmu) m/s qui dépend de la longueur des cellules et du degré de confinement, et tend également à varier entre les répliques (Fig. 1b, c). À (_<< m>> <,>gtrsim <,>0,01) , (_<0>) augmente progressivement, jusqu'à un facteur deux, à mesure que (Delta E(_<< m>>)) grandit et le mouvement collectif s'est développé, conformément au comportement précédemment rapporté 2 .

Dépendance de la chimiotaxie sur la densité cellulaire

La réponse chimiotactique des cellules au gradient MeAsp a d'abord été quantifiée en utilisant leur vitesse de dérive chimiotactique (_<< m>>) , c'est-à-dire la vitesse de déplacement moyenne de la population vers le haut du gradient, mesurée comme détaillé dans la section « Méthodes » à la suite de Colin et al. 49 . Le gradient de concentration en MeAsp (de 0 à 200 (upmu) M en 2 mm) a été choisi pour maximiser (_<< m>>) à faible densité cellulaire 49 . Pour toutes les combinaisons de longueur de cellule (L) et de hauteur de canal (h) , nous avons observé que la dérive chimiotactique (_<< m>>) a d'abord tendance à augmenter lorsque la fraction volumique des cellules (_<< m>>) augmente dans la plage (5 1<0>^<-4>-0.01) . Elle décroît alors fortement au-dessus d'une fraction volumique cellulaire (_<< m>>) qui dépend de (L) et (h) , correspondant à celui au dessus duquel on observe un comportement collectif (Fig. 3a). De manière cohérente, la dérive décroît en fonction de (Delta E(_<< m>>)) , bien que différemment pour chaque (L) et (h) (Fig. 5 supplémentaire). Le mouvement collectif tourbillonnant altère donc clairement la capacité des cellules à effectuer une chimiotaxie.

Effet du mouvement collectif sur la dérive chimiotactique. une, Dérive chimiotactique (_<< m>>) en fonction de la densité cellulaire pour les valeurs indiquées de longueur de cellule (L) et de hauteur de canal (h). b Coefficient chimiotactique (_<< m>>/_<0>^<2>) en fonction de la densité cellulaire. c Coefficient chimiotactique normalisé à sa valeur de faible densité en fonction de la densité cellulaire (c) ou de l'amplitude (Delta E(_<< m>>)) du mouvement collectif (). Les étiquettes tout au long de la figure sont définies dans le panneau (une). Chaque point représente la médiane de 8 expériences. Les barres d'erreur représentent le SEM en abscisse et la somme du SEM et de l'erreur de mesure moyenne en ordonnée.

Étant donné que la dérive chimiotactique dépend à la fois de la vitesse de nage des cellules et de leur capacité à biaiser leur direction de mouvement vers le gradient - l'efficacité chimiotactique, nous avons cherché à séparer ces deux contributions en normalisant (_<< m>>) à la vitesse de nage (_<0>) . Pour les cellules sans interaction en 3D dans un gradient chimique, on s'attend à ce qu'elles soient liées par 51,52,53 :

où (G) est le gain total du système de chimiotaxie, (f(c)) est la partie de la différence d'énergie libre des chimiorécepteurs due à la liaison du ligand chimique, présent aux concentrations (c) et ( au) est le temps typique pendant lequel la bactérie est capable de mesurer un changement de (f(c)) dans une direction donnée. Ce dernier dépend de l'échelle de temps mémoire (< au >_<< m>>) ainsi que sur deux temps de réorientation. La première est due à la diffusion rotationnelle brownienne au cours des essais, (< au >_<< m>>=1/_<< m>>) , avec (_<< m>>) la constante de diffusion rotationnelle des cellules isolées. L'autre est due à la culbute, (< au >_<< m>>=< au >_<0>/(1-exp (-_< au >_<< m>>))) , avec (< au >_<0>) le taux de dégringolade en régime permanent et (_< au >_<< m>>) la variation angulaire quadratique moyenne pendant les culbutes. Il est attendu des études précédentes 51,52,54 que (Note complémentaire 2) :

En l'absence d'interactions, d'après l'Eq. 2, le coefficient chimiotactique (_<< m>>/_<0>^<2>) ne dépend que des paramètres internes — fixes — de la voie de chimiotaxie et du profil de concentration fixe. Cette quantité a donc été choisie pour quantifier l'efficacité chimiotactique à toutes les densités, bien qu'à des densités élevées, le comportement des cellules puisse s'écarter de l'Eq. 2. Nous avons observé que le coefficient chimiotactique (_<< m>>/_<0>^<2>) , comme la dérive chimiotactique, a tendance à augmenter avec la fraction volumique, culmine à une condition dépendante (_<< m>>) autour de (0,01) , avant de décroître fortement — jusqu'à un facteur 100 — au fur et à mesure que le mouvement collectif se développe (Fig. 3b). Nous avons donc conclu que le maximum intermédiaire de (_<< m>>) et sa réduction subséquente par le mouvement collectif découlent de l'effet de la densité cellulaire sur l'efficacité chimiotactique, et que l'augmentation modérée de la vitesse de nage à haute densité cellulaire ne peut pas compenser la dépendance à la densité beaucoup plus forte du coefficient chimiotactique.

La chimiotaxie s'est également avérée être affectée par la longueur des cellules et la hauteur des canaux. Même à faible fraction de volume cellulaire, si les cellules sont plus longues ou dans un canal plus élevé, elles ont un coefficient chimiotactique plus élevé (_<< m>>/_<0>^<2>) (Fig. 3b). L'allongement des cellules devrait en effet entraîner une augmentation du coefficient chimiotactique dans les gradients stables 55, en raison de la diffusion rotationnelle brownienne inférieure des cellules plus longues 51 et de leur angle de culbutage réduit attendu 42,56. Pour comparer directement l'effet pur de la densité cellulaire sous divers (L) et (h) , les coefficients chimiotactiques ont été normalisés à la valeur moyenne aux fractions de faible volume ( (_<< m>> <,>< <,>0.0015) ) dans chaque condition (Fig. 3c). Même ce coefficient chimiotactique normalisé est significativement plus élevé pour les cellules plus longues à (_<< m>> <,>> <,>0.01) sous confinement modéré ( (h=50) et (30 upmu) m, Fig. 3b). C'est cependant une seule fonction de (_<< m>>) , quelle que soit la longueur de la cellule, pour (h=8 upmu) m (Fig. 3c).

Le comportement du coefficient chimiotactique rappelle ainsi celui de (E(_<< m>>)) . En effet, le coefficient chimiotactique normalisé s'est avéré être une fonction unique de l'amplitude du mouvement collectif (Delta E(_<< m>>)) , indépendamment de la longueur de la cellule et de la hauteur du canal (Fig. 3d), décroissant exponentiellement en fonction de (Delta E(_<< m>>)) à partir de sa valeur de faible densité. L'amplitude du mouvement collectif semble donc déterminer la réduction de la capacité à suivre les gradients, quelle que soit la taille du vortex (pi /_<< m>>) , pour (_<< m>> <,>gtrsim <,>0.01) , dans toutes les conditions.

Les réorientations collectives altèrent la chimiotaxie

Comme l'effet indirect de la distorsion du gradient par les bactéries nageuses pourrait être exclu (Fig. 1), nous avons émis l'hypothèse que la réduction observée de la chimiotaxie à haute densité est due aux réorientations forcées résultant des interactions physiques, qui interféreraient avec la détection. mécanisme basé sur des comparaisons temporelles : Pendant que la cellule nage, elle surveille l'évolution de la concentration en chimioattractant en quelques secondes, pour décider si elle doit basculer. Si pendant ce temps, la direction dans laquelle la cellule nage a changé de manière significative, la décision devient moins pertinente, rendant ainsi inefficace la stratégie de chimiotaxie bactérienne câblée biochimiquement. Dans cette hypothèse, les réorientations collectives agiraient alors de manière analogue à une amélioration de la diffusion rotationnelle, où l'échelle de temps de détection ( au) diminuerait car (_<< m>>) augmente effectivement 52,53,57 , réduisant le coefficient chimiotactique en conséquence (Eqs. 2 et 3).

Pour tester si les réorientations collectives peuvent effectivement réduire la dérive chimiotactique, nous avons effectué des simulations numériques d'une population de tiges chimiotactiques automotrices de rapport d'aspect variable (L) dans un milieu visqueux, le mouvement cellulaire étant confiné à deux dimensions. Les cellules interagissent stériquement au contact ainsi que hydrodynamiquement (Fig. 4a), étant transportées et réorientées par le flux généré par les autres cellules, qui ont été approximées comme des dipôles de force de poussée dans la géométrie Hele-Shaw 8,58. La force et la portée de l'interaction hydrodynamique dépendent de la hauteur du canal dans cette approximation en raison du frottement visqueux sur les parois (Méthodes et Fig. 6 supplémentaire). Les tiges se réorientent en rotation lors du culbutage, la probabilité de culbutage étant déterminée en fonction de la concentration d'agent chimiotactique subie par la tige, en utilisant un modèle du système de chimiotaxie de E. coli 59 . Ils sont également soumis à un mouvement brownien de rotation, avec le coefficient de diffusion rotationnel (_<< m>>) étant plus petit pour les cellules plus longues 55 .

Simulations numériques de tiges chimiotactiques automotrices en interaction en 2D. une Représentation schématique de l'interaction stérique simulée entre les tiges, où l'interpénétration ( (delta) ) entraîne une répulsion de type hertzien ( (_<< m>>) ) et le frottement ( (_<< m>>) ), et le débit de fluide généré par le dipôle de force hydrodynamique, ici pour la hauteur du canal (h=30 upmu) m. Pour les autres hauteurs, voir Fig. 6. b Instantané d'une sortie de simulation (longueur (L=4 upmu) m, (h=30 upmu) m, (Phi =0.244) ), montrant le mouvement collectif de paquets de tiges. L'ombrage vert représente le dégradé. c Facteur de structure d'écoulement (E(q)) pour les conditions indiquées, présentant un maximum croissant à un (_<< m>>) en fonction uniquement de la hauteur du canal (h) . L'assombrissement d'une couleur donnée indique une fraction de zone croissante dans la plage (0.002-0.25) . Maximum soustrait de sa valeur de faible densité, (Delta E(_<< m>>)) , en fonction de la fraction de surface cellulaire. (Encart) Taille de vortex typique (pi /_<< m>>) en fonction de la hauteur du canal. Notez la différence d'échelle par rapport à la figure 2c. e Coefficient chimiotactique en fonction de la fraction de surface cellulaire. Les lignes pointillées représentent sa valeur en l'absence d'interactions. F, Coefficient chimiotactique, normalisé à sa valeur de faible densité, en fonction du maximum du facteur de structure d'écoulement (Delta E(_<< m>>)) . g Autocorrélations temporelles de la vitesse des cellules, le codage couleur est le même que dans (c). h Coefficient chimiotactique en fonction du temps de décorrélation (< au >_<< m>>) , défini par (_(< au >_<< m>>)=0,5) , et ajuster selon l'Eq. (4). F, h, Les conditions sont comme indiqué dans le panneau et les barres d'erreur représentent SEM sur au moins 3 courses, totalisant au moins 1000 cellules.

Lorsque la fraction de surface cellulaire augmente dans les simulations, les tiges forment des paquets de cellules tourbillonnantes de plus en plus grandes, de la même manière que dans les rapports précédents, que des interactions hydrodynamiques soient présentes 8,14,20,58 (simulations complètes, Fig. 4b) ou non 23,24 (simulations stériques uniquement, Fig. 7). Cependant, un meilleur accord qualitatif avec les expériences est obtenu lorsque les interactions hydrodynamiques sont prises en compte, suggérant qu'elles sont le principal contributeur à l'émergence du mouvement collectif dans ce cas. Notamment, lorsque l'hydrodynamique est prise en compte, le facteur de structure d'écoulement (E(q)) culmine à un (_) qui ne dépend que de la hauteur du canal et non de la densité ou de la longueur des cellules, en accord avec les expériences (Fig. 4c), bien que la taille du vortex simulé soit plus petite que celle expérimentale. En revanche, lorsque seules les interactions stériques sont simulées, (_>) dépend clairement de la longueur de la cellule (Fig. 7d). Les dépendances de (E(_<< m>>)) sur la hauteur du canal, la longueur des cellules et la densité des cellules dans les simulations complètes sont similaires aux expériences (Fig. 4d). De même, la vitesse de nage (_<0>) augmente dans les simulations complètes, bien que dans une moindre mesure que dans les expériences, alors qu'il diminue dans le cas uniquement stérique (Fig. 8 supplémentaire), suggérant que cette augmentation est due à l'entraînement hydrodynamique et confirmant davantage l'importance des interactions hydrodynamiques dans l'émergence du mouvement collectif.

Dans les simulations complètes, le coefficient chimiotactique (_<< m>>/_<0>^<2>) , tracé en fonction de la fraction de surface corporelle cellulaire, diminue aux densités cellulaires où se développe le mouvement collectif (Fig. 4e). Cependant, contrairement aux expériences, aucune augmentation du coefficient chimiotactique n'est observée au niveau des fractions de surface cellulaire intermédiaire. Néanmoins, (_<< m>>/_<0>^<2>) est mis à l'échelle avec (E(_<< m>>)) , comme dans les expériences, mais avec une diminution plus marquée (Fig. 4f). Dans les simulations stériques uniquement, (_<< m>>/_<0>^<2>) à la place des pics en fonction de la fraction de surface cellulaire à des densités élevées, mais ce n'est pas une fonction unique de (E(_<< m>>)) (Fig. 7e supplémentaire).

Enfin, nous avons profité de l'accès à toutes les trajectoires unicellulaires dans les simulations pour mieux comprendre le mécanisme de réduction de la dérive chimiotactique. L'autocorrélation temporelle de la vitesse des cellules individuelles (<<f>>_) , (_(t)=>>_(t+_<0>)cdot <<f>>_(_<0>) ight angle >_<>_<0>>/>>_^<2>(_<0>) ight angle >_<>_<0>>) , montre une décorrélation plus rapide lorsque la densité cellulaire augmente pour toutes les valeurs de (h) et (L) , en raison des réorientations collectives (Fig. 4g). Nous avons utilisé le temps de décorrélation, défini comme (_(< au >_<< m>>)=0,5) , comme mesure de la persistance directionnelle (Fig. 9a supplémentaire). En l'absence de toute interaction physique, le temps de décorrélation dépend des temps de réorientation brownien et tumbling comme (1/< au >_<< m>>=1/< au >_<< m>>+1/< au >_<< m>>) , et en combinant les équations. 2 et 3, le coefficient chimiotactique peut s'écrire :

À des densités de cellules plus élevées, (< au >_<< m>>) inclut également les réorientations collectives, (1/< au >_<< m>>=1/< au >_<< m>>^<< m>>+1/< au >_<< m>>) , avec (1/< au >_<< m>>^<< m>>=1/< au >_<< m>>+1/< au >_<< m>>) un taux de diffusion rotationnel effectif incluant le brownien ( (< au >_<< m>>) ) et collectif ( (< au >_<< m>>) ) temps de réorientation. Malgré cette contribution supplémentaire du mouvement collectif, la dépendance du coefficient chimiotactique simulé en fonction de (< au >_<< m>>) s'avère suivre l'équation. 4 très bien à toutes les densités, avec les valeurs de coefficient calculées et non ajustées données dans le tableau supplémentaire 2, pour toutes les conditions dans les simulations complètes (Fig. 4h). L'effet du mouvement collectif simulé peut donc être interprété comme une amélioration active de la diffusion rotationnelle, qui diminue (< au >_<< m>>^<< m>>) , d'où (< au >_<< m>>) et la dérive. En revanche, le coefficient chimiotactique ne correspond pas bien à la dépendance du temps de réorientation prédit par l'équation. 4 lorsque seules les interactions stériques sont prises en compte (Note complémentaire 3 et Fig. complémentaire 6h). Notamment, les réorientations provenant des interactions physiques cellule-cellule ne respectent pas nécessairement l'équilibre détaillé des flux d'orientation des cellules, comme le fait la diffusion rotationnelle brownienne, ce qui peut expliquer les écarts par rapport à l'équation. 4 que nous avons observé même lorsque les interactions hydrodynamiques sont prises en compte (Note complémentaire 4 et Figs. complémentaires 9 et 10).


Surveillance de la croissance bactérienne dans différentes conditions environnementales

Les organismes microbiens, tels que les bactéries, jouent un rôle essentiel dans de nombreuses facettes de la vie moderne. Ils sont utilisés pour la production de produits médicaux, l'assainissement de l'environnement, la recherche biomédicale et la production alimentaire, pour ne citer que quelques utilisations différentes. La capacité de manipuler et de sélectionner différentes souches avec des caractéristiques spécifiques a été primordiale pour leur utilité. De même, le développement de nouvelles souches nécessite souvent le suivi de la croissance des souches dans diverses conditions. L'utilisation du lecteur de microbiologie Agilent BioTek LogPhase 600 pour contrôler la température, agiter la suspension et surveiller la croissance bactérienne à l'aide de la diffusion de la lumière dans des microplaques à 96 puits est décrite ici.

Introduction

Les bactéries jouent un rôle essentiel dans l'industrie de plusieurs manières qui exploitent leurs capacités naturelles. Ils sont utilisés dans la fabrication d'aliments et la production d'antibiotiques, de probiotiques, de médicaments, de vaccins, de cultures de démarrage, d'insecticides, d'enzymes, de carburants et de solvants. Dans l'industrie alimentaire, les bactéries lactiques telles que Lactobacilles, Lactocoque, et Streptocoque sont utilisés dans la fabrication de produits laitiers tels que les fromages et les yaourts. Les bactéries lactiques et les bactéries acétiques sont utilisées dans les processus de décapage d'articles tels que les olives, les cornichons et la choucroute, tandis que les fermentations bactériennes sont utilisées dans le traitement de la sauce de soja. Dans l'industrie pharmaceutique, les bactéries sont utilisées pour produire des antibiotiques, des vaccins et des enzymes médicalement utiles. L'assainissement des sols et des déchets peut être renforcé par l'utilisation de bactéries pour métaboliser des polluants spécifiques.

Pour optimiser leur efficacité, des souches bactériennes poussant dans des conditions environnementales spécifiques ont été sélectionnées. Afin de sélectionner des bactéries avec ces attributs, les souches bactériennes sont cultivées en suspension dans diverses conditions expérimentales et les souches avec le taux de croissance le plus élevé identifié. La croissance des bactéries dans la culture en suspension peut être surveillée en utilisant des mesures de turbidité ou de diffusion de la lumière. Au fur et à mesure que le nombre de cellules augmente, la solution devient de plus en plus trouble ou trouble car la lumière qui la traverse est diffusée par les micro-organismes présents. 1 Bien que n'obéissant pas à la loi de Beer, à mesure que la diffusion de la lumière augmente, le pourcentage du faisceau lumineux total atteignant le détecteur diminue et est enregistré en tant qu'absorbance.

Les bactéries cultivées en suspension augmenteront en nombre avec le temps. Si la diffusion de la lumière est contrôlée par absorbance, une courbe en forme de sigmoïde est observée (Figure 1). Après l'inoculation initiale, le nombre de bactéries est assez faible et les bactéries présentes s'adaptent au nouvel environnement. Cette étape, appelée phase de latence, montre très peu de changement de densité optique (DO). En phase log, la croissance s'accélère et le nombre de bactéries devient important, des changements rapides de DO sont observés. À mesure que les nutriments se raréfient et que les déchets s'accumulent, la croissance ralentit et la culture entre en phase stationnaire.

Le lecteur de microbiologie LogPhase 600 effectue une DO cinétique600 déterminations, tout en assurant le contrôle de la température et l'agitation jusqu'à quatre microplaques à 96 puits distinctes. L'application logicielle associée fournit une interface utilisateur simple pour saisir les paramètres de lecture.À la fin de l'analyse, l'application fournit également des mesures d'analyse telles que la longueur de la phase de latence, le taux de croissance maximal et le temps jusqu'à la densité optique maximale. Le lecteur utilise la capacité des microplaques pour évaluer un grand nombre de conditions expérimentales dans une petite empreinte standardisée. La capacité d'accueillir simultanément quatre microplaques à 96 puits augmente encore les possibilités expérimentales.

Figure 1. Courbe de croissance cinétique bactérienne typique.

Matériaux et méthodes

Les poudres de milieux, les produits chimiques secs et l'éthanol ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Les milieux de bouillon LB et 2XYT ont été préparés comme indiqué et stérilisés par autoclavage. Le milieu LB consistait en 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 5 g de NaCl par litre, tandis que 2XYT consistait en 16 g de tryptone, 10 g d'extrait de levure et 5 g de NaCl par litre de solution. Les microplaques transparentes stériles à fond plat (numéro de pièce 3598) provenaient de Corning (Corning, NY). Les scellants pour plaques TopSeal-A optiquement transparents, numéro de catalogue 6005185, ont été obtenus auprès de PerkinElmer (Boston, MA). JM109 Souche de E. coli a été obtenu auprès de Life Technologies (Carlsbad, CA).

Toutes les expériences ont suivi le même format général. Des cultures mères pendant une nuit (50 ml) ont été cultivées dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml à 37 °C avec agitation orbitale à 200 tr/min. Avant les expériences de croissance, les cultures bactériennes ont été diluées à 1:500 avec des milieux frais. Les cellules diluées ont ensuite été étalées selon les besoins dans des plaques transparentes à fond plat Corning 3598 dans un volume total de 150 µl. Les mesures ont été effectuées toutes les 2,5 à 10 minutes avec une agitation orbitale continue (800 tr/min) à l'aide d'un lecteur de microbiologie Agilent BioTek LogPhase 600 réglé à 37 °C pendant 12 heures. Le lecteur a été contrôlé et les données ont été collectées à l'aide de l'application Agilent BioTek Microbial Growth.

Toutes les expériences nécessitaient qu'une partie du milieu de croissance dans le puits soit remplacée par le ou les composés expérimentaux, le volume final du puits de la microplaque étant toujours de 150 µL. Sauf indication contraire, les ajouts expérimentaux ont été dilués dans de l'eau. Dans chaque expérience, tous les échantillons avaient le milieu de croissance dilué de manière égale pour comparaison.

Résultats et discussion

Comparaison des formulations des milieux de croissance
Deux formulations de milieux différentes couramment utilisées ont été initialement testées pour leurs caractéristiques de croissance. Comme le montre la figure 2, les deux formulations fournissent des courbes de croissance significatives et presque équivalentes lorsqu'elles sont utilisées non diluées. Alors que 2XYT a pu se développer E. coli à une densité et un taux de croissance légèrement plus élevés, les différences n'étaient pas dramatiques par rapport aux différences de formulation.

Figure 2. Comparaison de E. coli croissance des formulations de milieux LB et 2XYT. Des puits d'une microplaque à 96 puits ont été inoculés avec E. coli et l'absorbance a été contrôlée cinétiquement toutes les 5 minutes pendant 12 heures. Les données représentent la moyenne de huit puits.

Étant donné que plusieurs expériences nécessiteront que le milieu soit dilué dans une certaine mesure à des fins expérimentales, les deux formulations ont été diluées avec de l'eau à divers pourcentages par rapport à la recette définie. Dans ces conditions, le 2XYT a fourni des taux de croissance presque optimaux à des concentrations beaucoup plus faibles (figure 3). Ce n'était pas inattendu, car la formulation utilise considérablement plus des mêmes constituants par volume que le milieu LB. Toutes les expérimentations ultérieures ont utilisé des supports 2XYT.

Figure 3. Taux de croissance de E. coli avec diverses concentrations de milieux bactériens. Les milieux LB et 2XYT ont été dilués avec de l'eau et inoculés avec E. coli et la croissance est surveillée cinétiquement. Le taux de croissance maximum pour chaque puits a été déterminé et tracé en fonction de la concentration du milieu de croissance. Les données représentent la moyenne et l'écart type de huit déterminations.

Effet des niveaux de NaCl sur les taux de croissance

Pour examiner l'effet du NaCl sur la croissance des bactéries, une partie du milieu 2XYT a été remplacée par des dilutions de NaCl dans l'eau. Comme le montre la figure 4, l'augmentation de la salinité de l'environnement réduit le taux de croissance des E. coli. A des concentrations très élevées, il n'y a pratiquement pas de croissance bactérienne.

Figure 4. Taux de croissance de E. coli avec diverses concentrations de milieux bactériens. Les milieux LB et 2XYT ont été dilués avec de l'eau et inoculés avec E. coli et la croissance a été surveillée cinétiquement. Le taux de croissance maximum pour chaque puits a été déterminé et tracé en fonction de la concentration du milieu de croissance. Les données représentent la moyenne et l'écart type de huit déterminations.

Effet des niveaux de pH
Le pH environnemental peut avoir un effet profond sur la croissance bactérienne. Un système tampon à large plage a été utilisé pour maintenir les niveaux de pH de 2,5 à 12,3. Une partie du milieu de croissance a été remplacée par du tampon et les puits ont été inoculés avec E. coli. Comme le montre la figure 5, il n'y a pratiquement pas de croissance à des niveaux de pH inférieurs à 5,5. Les taux de croissance augmentent rapidement à mesure que le pH augmente, avec un taux maximal à pH 7,5. L'augmentation du pH au-dessus de 7,5 entraîne une réduction du taux de croissance avec à pH 12 environ 60 % du maximum (figure 5).

Figure 5. Effet du pH du milieu sur la croissance bactérienne. 100 &mL de diluer E. coli des cultures dans des milieux 2XYT ont été ajoutées aux puits d'une microplaque avec 50 µL de tampon universel à différents niveaux de pH. La croissance a été suivie cinétiquement pendant 12 heures et la vitesse de croissance maximale a été tracée en fonction du pH. Les données représentent la moyenne et l'écart type de huit déterminations.

Figure 6. Comparaison de la croissance bactérienne en présence de diverses molécules de sucre. Le milieu 2XYT additionné de 100 µM du sucre indiqué a été ensemencé avec E. coli et la croissance contrôlée cinétiquement. Le graphique à barres représente la moyenne et l'écart type de huit déterminations.

Le disaccharide saccharose, qui est composé des monosaccharides de glucose et de fructose, ne confère pas la même augmentation du taux de croissance. Ceci suggère que cette souche n'a pas la capacité de cliver efficacement la liaison glycosidique entre les deux monosaccharides ou que le coût énergétique est équivalent au gain conféré par la libération de glucose. L'inositol, un sous-produit métabolique du glucose par le rein, entraîne une diminution du taux de croissance lorsqu'il est ajouté à E. coli des cultures.

Un certain nombre de molécules glucidiques non sucrées ont également été utilisées pour compléter E. coli des cultures. Fait intéressant, l'ajout de 50 µM de la molécule de pyruvate à trois carbones a entraîné une augmentation de 38 % du taux de croissance maximal par rapport aux puits témoins (figure 7). L'acétate, une fraction à deux carbones, a entraîné une diminution de 26 % et le citrate a complètement aboli la croissance à des concentrations similaires. Ces changements de taux de croissance n'étaient pas le résultat de changements de pH causés par l'ajout de ces acides organiques faibles, car les cultures contenaient également 50 mM d'Hepes (pH 7,5) comme moyen d'atténuer le pH en tant que variable.

Figure 7. Comparaison du taux de croissance bactérienne en présence de petites molécules de carbone. Le milieu 2XYT, additionné de 50 µM de la molécule indiquée et de 50 mM d'Hepes (pH 7,5), a été inoculé avec E. coli et la croissance contrôlée cinétiquement. Le graphique à barres représente la moyenne et l'écart type de huit déterminations.


Inhibition des vitesses de croissance par ajout de solvants
La présence de solvants peut affecter la croissance bactérienne. Comme le montre la figure 8, des quantités croissantes de plusieurs solvants couramment utilisés dans les systèmes biologiques peuvent avoir une influence marquée sur le taux de croissance. La présence de tétrahydrofurane à plus de 0,5 % a aboli la croissance bactérienne, alors que la présence de 5 % de DMSO est tolérée. Fait intéressant, de faibles concentrations de DMSO augmentent le taux de croissance par rapport aux témoins non traités.

Figure 8. Effet des solvants sur la croissance bactérienne. Diverses concentrations de quatre différents solvants couramment utilisés ont été ajoutées au milieu 2XYT et la croissance de E. coli suivi cinétiquement. Le taux de croissance maximal de chaque puits a été calculé et tracé en fonction de la concentration de solvant. Chaque point de données représente la moyenne et l'écart type de huit déterminations.

Ces données démontrent l'utilité du lecteur de microbiologie LogPhase 600 pour caractériser les souches bactériennes en utilisant la diffusion de la lumière comme moyen de quantifier le taux de croissance. En utilisant la souche JM109 de E. coli, les effets de plusieurs additifs de milieux différents sur la croissance bactérienne ont été étudiés. Ils servent d'exemples de preuve de concept pour tester la croissance bactérienne dans des conditions expérimentales à l'aide du LogPhase 600.

La sélection de souches bactériennes qui se développent dans des conditions définies est utilisée dans un certain nombre de scénarios différents. Par exemple, l'assainissement des sols utilise souvent des bactéries qui peuvent utiliser des polluants spécifiques comme source d'énergie. Les zones avec un patrimoine industriel à long terme ont entraîné la formation de friches industrielles. Les friches industrielles contiennent souvent des hydrocarbures pétroliers, des polluants organiques persistants, tels que les PCB, et des métaux toxiques. L'identification de bactéries spécifiques qui peuvent métaboliser ces composés et les utiliser comme source de carbone a le potentiel d'atténuer une partie de leur toxicité. Les souches utilisées devraient idéalement avoir : (a) une capacité supérieure à dégrader les contaminants cibles (b) être faciles à cultiver (c) permettre une croissance rapide (d) avoir une tolérance à la concentration élevée de contaminants et (e) la capacité de survivre dans un large éventail de conditions environnementales/de facteurs de stress. 4 L'identification des bactéries qui répondent le mieux à ces critères nécessite le test de nombreuses souches de bactéries.

Conclusion

Le lecteur de microbiologie Agilent BioTek LogPhase 600 est une plate-forme idéale pour entreprendre ce type d'expériences. Contrairement aux autres lecteurs de microplaques traditionnels, le lecteur LogPhase 600 est capable de contenir jusqu'à quatre plaques 96 puits simultanément. Étant donné que les quatre plaques sont contenues dans le même environnement de lecture pendant toute la durée de l'expérience, une véritable comparaison de jusqu'à 384 points de données peut être effectuée. Le lecteur fournit un contrôle de la température de 30 à 45 °C, par incréments de 1 °, en conjonction avec une agitation orbitale. Le lecteur a été conçu dès le départ pour une agitation continue, avec un mécanisme de contrepoids robuste qui réduit le bruit et les vibrations. La vitesse d'agitation peut être modifiée de 500 à 800 tr/min ou désactivée, si nécessaire. La source lumineuse LED fournit une lumière spécifique à la longueur d'onde pendant toute une vie sans avoir besoin de changer de lampe. Les tests peuvent durer jusqu'à 72 heures et peuvent être programmés sans intervention. Pendant les longs essais, le dosage peut être temporairement interrompu puis redémarré sans perte d'intégrité des données, si nécessaire.

Une application logicielle dédiée est utilisée pour configurer le test. À l'aide de l'application, la température d'incubation, la durée du dosage, l'intervalle de lecture et la vitesse d'agitation sont définis. Pendant l'analyse, de petites icônes représentant chaque puits sont indiquées. Un clic de souris sur n'importe quel puits fournit un OD agrandi600 terrain. Si vous le souhaitez, plusieurs tracés peuvent être superposés à des fins de comparaison. À la fin de l'analyse, le temps de latence, le taux de croissance maximal et le temps jusqu'à la DO maximale sont calculés. Les données brutes et calculées peuvent ensuite être facilement exportées sous forme de fichier Excel ou texte, si une analyse plus approfondie des données est souhaitée.


3. RÉSULTATS

3.1 Efficacité de l'inhibiteur de TLR8 CU-CPT9b dans le sang

Pour déterminer la concentration minimale de CU-CPT9b requise pour bloquer la fonction TLR8, du sang anticoagulé a été prétraité avec l'inhibiteur ou le composé témoin à différentes concentrations pendant 120 min, puis les agonistes TLR8 pU ou CL075, l'agoniste TLR4 LPS, ou le véhicule témoin (PBS) ont été ajoutés. Les analyses de cytokines dans le plasma après 240 min de traitement ont révélé que l'inhibiteur de TLR8 bloquait efficacement la production induite par CL075 de TNF, IL-1β et IL-6 à la dose la plus faible testée (2,5 µM), alors que la réponse induite par pU était complètement bloquée à 5 à 10 µM (Fig. 1A supplémentaire). L'IL-8 a montré une tendance similaire mais a été faiblement induite. La libération de cytokines induite par LPS n'a pas été affectée par CU-CPT9b, alors que le composé témoin (Fig. 1B supplémentaire) n'a pas influencé les réponses induites par TLR8 (Fig. 1A). Par conséquent, nous avons considéré que 5 µM de CU-CPT9b étaient optimaux pour l'inhibition de l'activation de TLR8 dans le sang, ce qui est similaire à nos récentes découvertes avec l'analogue CU-CPT9a dans des cultures de monocytes purifiés. 13

3.2 L'inhibition du TLR8 atténue l'induction des cytokines par le GBS et S. aureus en sang total

Pour déterminer l'impact de TLR8 pour la détection de bactéries viables dans le sang, nous avons prétraité le sang avec 5 µM de CU-CPT9b ou le réactif de contrôle pendant 120 min, puis ajouté pU, LPS, FSL-1 (TLR2/6 agoniste), ou GBS en direct, S. aureus ou E. coli à différentes doses. Le plasma sanguin a été séparé 240 min après le début de l'épreuve et les niveaux de cytokine ont été examinés. Comme prévu, le blocage de TLR8 a presque éliminé l'induction de cytokines par pU, alors qu'il n'a eu aucun effet sur l'induction de cytokines par LPS ou FSL-1 (Fig. 1). Plus important encore, CU-CPT9b a clairement réduit la production de cytokines après GBS et S. aureus défi. L'effet était le plus prononcé pour l'IL-12p70, l'IL-1β et le TNF, mais également significatif pour l'IL-6 pour les concentrations bactériennes inférieures. Il n'y a eu aucun effet majeur du traitement par CU-CPT9b sur la libération d'IL-8 ou de MCP-1 (données non présentées). De plus, l'induction de cytokines par E. coli était principalement indépendant de TLR8, ce qui est en accord avec nos récentes découvertes avec cette souche dans des cultures de monocytes. 13 Nous avons également inclus 2 isolats cliniques de E. coli qui activent dans une certaine mesure TLR8 dans les monocytes, mais aucun effet clair de CU-CPT9b sur l'induction de cytokines dans le sang n'a été trouvé (données non présentées). Dans l'ensemble, l'induction de cytokines par le GBS vivant et S. aureus le défi du sang humain est partiellement dépendant de TLR8, alors que E. coli est détecté principalement de manière indépendante du TLR8.

3.3 Viabilité des monocytes et des PMN et libération d'ADN et d'IL-8 par les PMN

L'intégrité de la membrane plasmique des monocytes et des PMN pendant le SGB et S. aureus la provocation de sang pendant 240 min a été examinée par coloration PI et analyse par cytométrie en flux. L'intégrité de la membrane des PMN, mais pas des monocytes, a été compromise lors de l'épreuve avec la charge bactérienne la plus élevée, mais l'inhibition de TLR8 n'a pas influencé cela (Fig. 2A). Pour examiner plus en détail si TLR8 a un rôle fonctionnel dans les PMN lors d'une infection bactérienne, des PMN purifiés ont été ensemencés dans des plaques de culture cellulaire et prétraités avec du CU-CPT9a (5 µM) et confrontés à des bactéries vivantes pendant 6 h. Les concentrations les plus élevées de GBS et S. aureus significativement augmenté les niveaux d'ADN extracellulaire dans le surnageant de culture (Fig. 2B). Les niveaux extracellulaires d'ADN sont en corrélation avec la perte d'intégrité de la membrane plasmique des PMN dans le sang et peuvent représenter des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) ou de l'ADN libéré via d'autres formes de mort cellulaire nécrotique. 30 Quoi qu'il en soit, les deux effets se sont produits indépendamment de la signalisation TLR8. En revanche, la production d'IL-8 par PMN en réponse aux deux bactéries a été partiellement réduite par l'inhibition de TLR8, le plus fortement pendant la provocation par GBS (Fig. 2B). Cela suggère que TLR8 contribue directement à la détection des bactéries dans les PMN.

3.4 Impact du complément et du CD14 sur les réponses des cytokines aux bactéries vivantes dans le sang

L'inhibition du complément au niveau de C3 ou C5 combinée au blocage de CD14 atténue la libération de cytokines dans le sang E. coli et S. aureus. 18, 22 Nous avons comparé l'efficacité de l'inhibiteur C3 Compstatine (CP40 aC3), de l'anticorps bloquant C5 éculizumab (aC5) et d'un anticorps bloquant CD14 lors d'une provocation avec le GBS, S. aureus et E. coli. Les niveaux de cytokines plasmatiques ont été déterminés après provocation pendant 120 minutes (Fig. 2A supplémentaire) et 240 minutes (Fig. 2B supplémentaire). L'inhibition de C3 ou C5 a partiellement atténué l'induction de l'IL-1β, du TNF, de l'IL-6 et de l'IL-8 par les bactéries Gram-positives pendant 120 minutes de provocation (Fig. 2A supplémentaire). La production de cytokines induite par le GBS a été peu affectée par le blocage de CD14, alors que l'induction de cytokines par S. aureus était plus atténué, en particulier la libération d'IL-6. L'anti-CD14 a fortement réduit l'induction des cytokines en E. coli, et lorsqu'il est combiné avec des inhibiteurs de C3 ou C5, une réduction encore plus importante a été obtenue (Fig. 2A supplémentaire). Les effets des inhibiteurs de C3 et C5 étaient moins clairs après 240 min, bien que l'induction de l'IL-6 par S. aureus était encore significativement réduit lorsqu'il était associé à un anti-CD14, et le E. coli la libération de cytokines induite est restée fortement atténuée. L'inhibition au niveau de C3 et C5 était presque aussi efficace (Fig. 2B supplémentaire). Étant donné que le blocage de C5 n'interfère pas avec l'opsonisation dépendante de C3b, cela semble être une cible meilleure et plus sélective que C3.

3.5 Effets de l'inhibition combinée des TLR8 et C5 dans le sang sur le SGB et S. aureus défi

En accord avec notre hypothèse, l'induction de cytokines par les bactéries Gram-positives dans le sang est à la fois dépendante de TLR8 et du complément. Ensuite, nous avons examiné si l'inhibition combinée de TLR8 et C5 pouvait atténuer davantage les réponses des cytokines. E. coli a été exclu de cette expérience, car il déclenchait principalement la production de cytokines dépendantes de CD14 et indépendantes de TLR8. CU-CPT9b a nettement diminué l'induction d'IL-1β et de TNF pendant 120 min de provocation avec GBS et S. aureus, avec l'effet le plus fort pour le SGB (Fig. 3A). L'inhibition de C5 a eu des effets similaires mais plus faibles, alors que l'inhibition combinée de C5 et TLR8 n'a pas réduit significativement les niveaux d'IL-1β et de TNF plus que l'inhibition de TLR8 seule. D'autre part, l'induction d'IL-8 par les deux bactéries pendant 120 min de provocation était fortement dépendante de C5, mais pas de TLR8. De plus, l'inhibition combinée n'a pas réduit l'IL-8 plus que l'inhibition de C5 seule (figure 3A). L'induction de l'IL-6 pendant 120 min de provocation avec le GBS dépendait à la fois de C5 et de TLR8, alors que S. aureus déclenché la libération anticipée d'IL-6 principalement via C5. L'inhibition combinée n'a pas réduit la libération d'IL-6 significativement plus que l'inhibition simple. Après 240 min de provocation, l'IL-12p70 a été induite, principalement d'une manière dépendante du TLR8 (Fig. 3B). De plus, l'effet de l'inhibition de C5 sur les autres cytokines était diminué, à l'exception de l'IL-6, alors que l'effet de CU-CPT9b avait augmenté et partiellement atténué également la production d'IL-8 pour la faible dose bactérienne. Pour la dose bactérienne élevée, aucune réduction significative des taux d'IL-8 n'a été obtenue avec les inhibiteurs (Fig. 3B). L'IL-6 était la plus fortement réduite lors de la combinaison des inhibiteurs C5 et TLR8. Dans l'ensemble, l'induction de cytokines dans le sang par les bactéries Gram-positives dépend à la fois de TLR8 et de C5, comme on l'a supposé. Nous avons observé un impact accru de TLR8 et un effet réduit de C5 à un moment ultérieur. Le blocage combiné de C5 et TLR8 a eu des effets additifs, notamment sur la production d'IL-6.

3.6 Impact de TLR8 et C5 sur la croissance et la survie des bactéries dans le sang

Pour examiner si l'inhibition de TLR8 ou de C5 influençait la survie bactérienne dans le sang, une aliquote d'échantillons de sang a été lysée, diluée et étalée sur gélose au sang. La viabilité (CFU/ml) du GBS a fortement augmenté pendant 240 min de provocation, alors que la S. aureus la viabilité a diminué (Fig. 4A). L'inhibition de C5 seul ou en combinaison avec TLR8 a encore augmenté le nombre de SGB viables dans le sang pour la dose bactérienne la plus élevée, alors que CU-CPT9b seul n'a eu aucun effet (Fig. 4A). Pour S. aureus, aucun des inhibiteurs n'a influencé le nombre de bactéries. Les bactéries à Gram positif sont généralement résistantes à la lyse directe médiée par le complément par le complexe d'attaque membranaire, et le GBS et S. aureus souche utilisée s'est répliquée efficacement dans le plasma de lépirudine, sans effet direct de CU-CPT9b sur la croissance bactérienne (Fig. 3 supplémentaire). Pour discriminer les bactéries viables intracellulaires et extracellulaires, les leucocytes (WBC) ont été isolés après 240 min de provocation bactérienne, lavés, lysés et étalés pour la quantification des UFC. Par rapport au sang total, peu de bactéries viables étaient présentes dans la fraction GB, ce qui suggère que les phagocytes tuent à la fois le SGB et S. aureus efficacement après phagocytose, et ceci était indépendant de TLR8 (Fig. 4B). Pour clarifier si TLR8 ou C5 affectait directement la phagocytose, l'absorption de bactéries marquées par fluorescence par les monocytes et les PMN dans le sang a été quantifiée par cytométrie en flux. L'anti-C5 ou un antagoniste des récepteurs C5a (C5aRA) a réduit l'absorption de GBS par les monocytes et les PMN pendant 60 et 120 min de provocation, alors que l'inhibition de TLR8 n'a eu aucun effet clair (Fig. 4A supplémentaire). Le traitement anti-C5 ou C5aRA a également réduit l'absorption de S. aureus pendant 60 min de provocation, alors que l'effet a diminué pendant une incubation plus longue, et l'inhibition de TLR8 n'a eu aucun effet clair (Fig. 4B supplémentaire).

Pris ensemble, TLR8 semble indispensable pour la phagocytose et la destruction bactérienne intracellulaire dans le modèle de sang total, tandis que C5 limite la croissance extracellulaire du SGB en facilitant la phagocytose via l'activation de C5aR1. Adoption de S. aureus dans la phase précoce dépend également de la signalisation C5a-C5aR1, mais cela devient redondant lors d'une provocation prolongée et n'est pas critique pour contrôler l'infection.

3.7 Effet de TLR8 et C5 sur l'activation de la coagulation par les bactéries

On pense que les troubles de la coagulation sont d'une importance majeure dans la septicémie. Par conséquent, nous avons examiné les effets de l'inhibition de TLR8 et C5 sur l'activation de la coagulation pendant l'infection. Comme la coagulation dans ce modèle est empêchée par la lépirudine, un inhibiteur de la thrombine, l'initiation de la coagulation a été examinée au stade du clivage de la prothrombine. Fragments de prothrombine (PTF1+2) dans le plasma ont été détectés par ELISA après 240 min de provocation bactérienne. GBS et S. aureus coagulation activée de manière C5-dépendante aux deux doses d'inoculum (Fig. 5). Avec CU-CPT9b seul, il y avait aussi une tendance à la réduction de PTF1+2 niveaux. L'inhibition combinée de C5 et TLR8 a donné un effet additif et a fortement réduit l'initiation de la coagulation déclenchée par les bactéries.

Ensemble, nos données indiquent que le TLR8 est important pour la production de cytokines pro-inflammatoires centrales dans le sang humain exposé au SGB vivant et S. aureus, tandis que E. coli est détecté principalement de manière indépendante du TLR8. Le TLR8 dans les PMN contribue à la libération d'IL-8 lors d'une provocation à Gram positif, bien que dans le sang total, la libération d'IL-8 soit principalement induite par C5. La production d'IL-6 et l'initiation de la coagulation dépendent à la fois de TLR8 et de C5, et l'inhibition combinée est un moyen efficace d'atténuer ces réponses. La phagocytose et la destruction bactérienne intracellulaire ne nécessitent pas de signalisation TLR8, alors que la signalisation via C5aR1 améliore la phagocytose et semble particulièrement importante pour limiter la croissance extracellulaire du SGB.


CONCLUSION

Étant donné que la sécurité alimentaire est une préoccupation majeure pour l'industrie alimentaire et les consommateurs, la recherche se poursuit constamment pour trouver des méthodes plus efficaces pour réduire ou tuer les agents pathogènes bactériens d'origine alimentaire. La présente étude révèle le modèle d'action de l'agent de nettoyage contre les bactéries isolées des boucheries qui sont fortement contaminées par des agents pathogènes bactériens. Cela énonce le rôle des aliments crus en tant que réservoir de bactéries pouvant être transférées à l'homme, provoquant ainsi des troubles gastro-intestinaux et des maladies d'origine alimentaire pouvant mettre la vie en danger. Des pratiques d'hygiène de base doivent être intégrées dans les abattoirs et les points de vente au détail de viande pour assurer la sécurité alimentaire. Une formation devrait être donnée aux manipulateurs de viande et aux bouchers concernant les pratiques de sécurité alimentaire et des procédures d'inspection appropriées devraient être strictement respectées pour minimiser la contamination de la viande crue et des produits carnés vendus sur les marchés. Parmi tous les agents de nettoyage, le jus de citron était plus efficace contre les bactéries que les autres agents. Des recherches sont actuellement en cours pour déterminer l'efficacité des agents de nettoyage sur d'autres bactéries pathogènes et d'altération du poulet et d'autres viandes.


Résultats

EFFETS DE LA DENSITÉ SUR LA FORME DU TUEUR

L'aptitude du producteur de toxine dépendait fortement de la densité initiale (Fig. 1 analyse de covariance (ANCOVA) : F1,24= 283.03, P < 0,00001). Comme toutes les cultures ont été cultivées jusqu'à la phase stationnaire, les différences entre les traitements de densité sont essentiellement dans la densité initiale et la longueur de la phase logarithmique, plutôt que dans la densité finale. Cela suggère que la production de toxines est neutre ou légèrement délétère à de faibles densités cellulaires et que les producteurs n'obtiennent un avantage que dans la ou les deux dernières divisions avant la phase stationnaire. Bien que ce même avantage existerait pour les producteurs dans tous les traitements expérimentaux, son effet sur l'aptitude globale par génération aurait été moindre dans les traitements avec de faibles densités initiales, car les producteurs devraient passer par de nombreuses divisions avant d'atteindre une densité suffisamment élevée pour que la toxine soit efficace contre les interférences. Les avantages de la production de toxine étaient, comme prévu, plus prononcés sur plaques qu'en culture liquide (ANCOVA factoriel complet : F1,24= 35.76, P < 0,00001). L'effet de la densité était bien plus important sur plaques qu'en culture liquide (ANCOVA factoriel complet : F1,24= 49.90, P < 0,00001). L'analyse par ANOVA a donné des résultats similaires sur la densité (F5,10= 122.45, P < 0,00001), structure spatiale (F1,10= 74.01, P < 0.00001), et densité par interaction structure (F5,10= 23.29, P < 0,00001).

Une densité plus élevée augmente le bénéfice de la production de toxines. Les barres claires et sombres représentent respectivement les environnements liquide et plaque. Les barres d'erreur représentent une plage d'écart type. Des cultures mixtes 50:50 de producteurs de toxines et de substances sensibles ont été initiées sur un gradient de densité, d'une dilution de 10 6 à 10 1 de la densité de culture liquide maximale. L'environnement, la densité et l'environnement × densité ont tous eu des effets statistiquement significatifs.

EFFETS DE LA FRÉQUENCE SUR LA FORME DU TUEUR

Nous avons constaté que la capacité d'un producteur de toxine à envahir une culture liquide (c'est-à-dire à avoir une forme physique relative >1) dépend de la fréquence (Fig. 2), les producteurs de toxines à des fréquences inférieures ayant une forme physique plus faible que les producteurs de toxines à des fréquences plus élevées (tableau 1), cohérent avec les résultats précédents avec d'autres systèmes microbiens ( Chao et Levin 1981 ). Cependant, nous avons constaté que les avantages de la production de toxines dans un environnement structuré spatialement étaient également fortement dépendants de la fréquence (tableau 2), contrairement aux systèmes précédemment rapportés (Chao et Levin 1981). Les producteurs de toxines à basse fréquence ne peuvent pas facilement envahir de rares, même lorsqu'il existe une structure spatiale, car leur aptitude est peu ou pas supérieure à celle de leurs concurrents sensibles. Il y avait des effets statistiquement significatifs sur la condition physique des tueurs en raison de l'environnement (ANCOVA factoriel complet : F1,24= 15.62, P= 0,001), fréquence initiale (ANCOVA : F1,24= 412.31, P < 0,00001), et dans l'interaction entre environnement et fréquence (ANCOVA : F1,24= 75.79, P < 0,00001). Une analyse de variance (ANOVA) n'a fourni qu'un soutien marginal pour un effet environnemental (F1,12= 3.31, P= 0,094), mais soutenait un effet de fréquence (F4,12= 22.12, P= 0,0001) et une interaction (F4,12= 4.05, P= 0,026). L'effet de la fréquence est plus prononcé dans l'environnement structuré spatialement, car les avantages sont plus importants à des densités plus élevées dans l'environnement structuré spatialement, mais les coûts par habitant restent probablement les mêmes quel que soit l'environnement de fréquence.

Une fréquence initiale faible réduit le bénéfice de la production de toxines. Les barres claires et sombres représentent respectivement les environnements liquide et plaque. Les barres d'erreur représentent une plage d'écart type. Des cultures mixtes de producteurs de toxines et de substances sensibles ont été initiées sur un gradient de fréquence, de 0,005 % à 50 % de producteurs de toxines à une dilution de 10 4 à partir de la densité maximale. L'environnement, la fréquence et l'environnement × fréquence ont tous eu des effets statistiquement significatifs.

Source de variation df SS MME Fs P
Régression linéaire 1 1.52×10 −2 1.52×10 −2 53.3 0.0053
Écart par rapport à la régression 3 8.53×10 −4 2.85×10 −4 0.268 0.847
Dans 15 1.59×10 −2 1.06×10 −3
Le total 19 3.19×10 −2
Source de variation df SS MME Fs P
Régression linéaire 1 9.48×10 −2 9.48×10 −2 524.7 0.00018
Écart par rapport à la régression 3 5.42×10 −4 1.81×10 −4 0.303 0.821
Dans 15 8.94×10 −3 5.96×10 −4
Le total 19 1.04×10 −1

EFFET DE KILLER SUR LE TAUX DE CROISSANCE

En l'absence de compétition killer versus sensitive, la production de toxine peut réduire la croissance, ce que nous avons observé par une approche plus rapide de la phase stationnaire par les cellules sensibles (Fig. 3). Le génotype tueur atteint un taux de croissance maximal plus tard, ∼ 332 min, que le non-producteur par ailleurs isogénique, ∼ 263 min, (Mann-Whitney à temps pour atteindre le taux de croissance maximal P= 0,01), bien que sans différence détectable dans le taux de croissance maximal (F1,8= 2.48, P > 0,1). Ce « décalage temporel » est évident dans la figure 4, où les souches non tueuses et tueuses ont des régressions quadratiques de forme similaire, mais avec le tueur décalé plus tard. La densité de phase stationnaire moyenne des cellules dans les cinq cultures de souches tueuses échantillonnées était de 4,72 × 10 7 cellules/mL (écart type 9,15 × 10 6 cellules/mL) et dans les cinq cultures sensibles était de 4,18 × 10 7 cellules/mL (écart type 9,18 × 10 6 cellules/mL). Nous avons donc déterminé que le plus petit inoculum utilisé dans l'expérience, le traitement liquide 10 -6 dans l'expérience de densité, contenait environ 40 cellules et était donc peu susceptible d'être fortement affecté par la variation stochastique. Nous n'avons trouvé aucune différence significative entre les densités de phase stationnaire des deux souches (ANOVA F1,8= 0.86, P= 0.379).

La production de toxines affecte la croissance, les cellules sensibles commençant plus rapidement. Les carrés et les cercles représentent les densités optiques moyennes sensibles et tueuses de cinq répétitions au cours d'une croissance séparée en culture liquide, respectivement. Les barres d'erreur indiquent des intervalles de confiance à 95 % basés sur m− 1 degrés de liberté. Les cultures de cellules sensibles sont systématiquement plus denses au cours d'une croissance exponentielle.

Les carrés et les cercles représentent les estimations du taux de croissance sensible et tueur au cours d'une croissance séparée en culture liquide, respectivement. Cinq réplicats de chacun sont présentés. Les levures se développent initialement lentement lors de l'inoculation dans un milieu frais, atteignent un taux de croissance maximal, puis déclinent à mesure qu'elles saturent leur environnement. Ces dynamiques de croissance sont bien ajustées par une régression quadratique (adj. r 2 = 0,80 et 0,86 pour le sensible et le tueur respectivement). La régression quadratique indique également un impact de killer sur la croissance (souche × temps F1,8= 8.07, P= 0,006), ce qui est particulièrement évident par la croissance initialement plus rapide et la baisse ultérieure plus précoce du taux de croissance du type sensible.


Courbes de croissance : génération de courbes de croissance à l'aide d'unités de formation de colonies et de mesures de densité optique

Source : Andrew J. Van Alst 1 , Rhiannon M. LeVeque 1 , Natalia Martin 1 et Victor J. DiRita 1
1 Département de microbiologie et de génétique moléculaire, Michigan State University, East Lansing, Michigan, États-Unis d'Amérique

Les courbes de croissance fournissent des informations précieuses sur la cinétique de croissance bactérienne et la physiologie cellulaire. Ils nous permettent de déterminer comment les bactéries répondent dans des conditions de croissance variables ainsi que de définir des paramètres de croissance optimaux pour une bactérie donnée. Une courbe de croissance archétypale progresse à travers quatre stades de croissance : décalage, exponentiel, stationnaire et mort (1).


Figure 1 : Courbe de croissance bactérienne. Les bactéries cultivées en culture discontinue progressent à travers quatre phases de croissance : latence, exponentielle, stationnaire et mort. Décalage La phase est la période de temps qu'il faut pour que la bactérie atteigne un état physiologique capable d'une croissance et d'une division cellulaires rapides. Exponentiel La phase est l'étape de la croissance et de la division cellulaires les plus rapides au cours de laquelle la réplication de l'ADN, la transcription de l'ARN et la production de protéines se produisent toutes à un rythme constant et rapide. Stationnaire est caractérisée par un ralentissement et un plafonnement de la croissance bactérienne en raison d'une limitation des nutriments et/ou d'une accumulation intermédiaire toxique. Décès La phase est l'étape au cours de laquelle la lyse cellulaire se produit en raison d'une grave limitation des nutriments.

La phase de latence est la période de temps nécessaire à la bactérie pour atteindre un état physiologique capable d'une croissance et d'une division cellulaires rapides. Ce décalage se produit parce qu'il faut du temps aux bactéries pour s'adapter à leur nouvel environnement. Une fois que les composants cellulaires nécessaires sont générés en phase de latence, les bactéries entrent dans la phase exponentielle de croissance où la réplication de l'ADN, la transcription de l'ARN et la production de protéines se produisent toutes à un rythme constant et rapide (2). Le taux de croissance et de division cellulaires rapides au cours de la phase exponentielle est calculé comme le temps de génération, ou le temps de doublement, et est le taux le plus rapide auquel les bactéries peuvent se répliquer dans les conditions données (1). Le temps de doublement peut être utilisé pour comparer différentes conditions de croissance afin de déterminer laquelle est la plus favorable à la croissance bactérienne. La phase de croissance exponentielle est la condition de croissance la plus reproductible car la physiologie des cellules bactériennes est cohérente dans toute la population (3). La phase stationnaire suit la phase exponentielle où la croissance cellulaire atteint un plateau. La phase stationnaire est provoquée par l'épuisement des nutriments et/ou l'accumulation d'intermédiaires toxiques. Les cellules bactériennes continuent à survivre à ce stade, bien que le taux de réplication et de division cellulaire soit considérablement réduit. La phase finale est la mort, où un épuisement sévère des nutriments conduit à la lyse des cellules. Les caractéristiques de la courbe de croissance qui fournissent le plus d'informations comprennent la durée de la phase de latence, le temps de doublement et la densité cellulaire maximale atteinte.

La quantification des bactéries en culture discontinue peut être déterminée en utilisant à la fois des unités formant colonie et des mesures de densité optique. Le dénombrement par unités formant colonies (UFC) fournit une mesure directe du nombre de cellules bactériennes. L'unité de mesure standard pour les UFC est le nombre de bactéries cultivables présentes par 1 mL de culture (CFU/mL) déterminé par des techniques de dilution en série et d'étalement sur plaques. Pour chaque point dans le temps, une série de dilutions 1:10 de la culture par lots est effectuée et 100 µl de chaque dilution sont étalés sur plaque à l'aide d'un étaleur de cellules.


Figure 2. Schéma de placage de dilution en série. Circulation générale pour le placage de dilution à partir de la culture par lots. La culture discontinue est diluée en série à 1:10 en transférant 1 ml de la dilution précédente dans le tube suivant contenant 9 ml de PBS. À partir de chaque tube de dilution, 100 µl sont étalés à l'aide d'un étaleur de plaques qui est une dilution supplémentaire de 1:10 car c'est 1/10 ème du volume de 1 mL de volume lors du calcul des UFC/mL. Les plaques sont incubées et dénombrées une fois que les colonies clonales se développent sur les plaques.

Les plaques sont ensuite incubées pendant une nuit et les colonies clonales sont dénombrées. La plaque de dilution qui a fait croître de 30 à 300 colonies est utilisée pour calculer le CFU/mL pour le temps donné (4, 5). La variation stochastique du nombre de colonies inférieures à 30 est sujette à une plus grande erreur dans le calcul des CFU/mL et le comptage des colonies supérieures à 300 peut être sous-estimé en raison de l'entassement et du chevauchement des colonies. En utilisant le facteur de dilution pour la plaque donnée, le CFU de la culture discontinue peut être calculé pour chaque point de temps.

La densité optique donne une approximation instantanée du nombre de cellules bactériennes mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre. La densité optique est une mesure de l'absorbance des particules lumineuses qui traversent 1 cm de culture et détectées par un capteur photodiode (6). La densité optique d'une culture est mesurée par rapport à un blanc de milieu et augmente au fur et à mesure que la densité bactérienne augmente. Pour les cellules bactériennes, une longueur d'onde de 600 nm (OD600) est généralement utilisée lors de la mesure de la densité optique (4). En générant une courbe standard concernant les unités de formation de colonies et la densité optique, la mesure de la densité optique peut être utilisée pour approximer facilement le nombre de cellules bactériennes d'une culture discontinue. Cependant, cette relation commence à se détériorer dès 0,3 OD600 à mesure que les cellules commencent à changer de forme et à accumuler des produits extracellulaires dans le milieu, influençant la lecture de la densité optique en ce qui concerne les CFU (7). Cette erreur devient plus prononcée pendant les phases stationnaires et de mort.

Ici, Escherichia coli est cultivé dans un bouillon Luria-Bertani (LB) à 37°C pendant 30 heures (7). Les courbes de croissance des UFC/mL et de la densité optique ont été générées ainsi que la courbe standard reliant la densité optique aux UFC. 


Figure 3. Escherichia coli courbe de croissance de la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm (DO600). Les valeurs de densité optique ont été prises directement à partir du spectrophotomètre après suppression avec un milieu LB stérile. Les valeurs OD600 supérieures à 1,0 ont été diluées à 1:10 en combinant 100 &# de culture avec 900 &# de LB frais, à nouveau mesurées, puis multipliées par 10 pour obtenir la valeur OD600. Cette étape est prise car la précision de la mesure du spectrophotomètre est réduite à une densité cellulaire élevée. A partir de la courbe, la phase de latence s'étend jusqu'à environ 1h de croissance, passe à la phase exponentielle de 2h à 7h, puis commence à plafonner, entrant en phase stationnaire. La phase de mort n'est cependant pas une transition brutale, car la densité optique commence progressivement à décliner après 15h.


Figure 4. Escherichia coli courbe de croissance de l'unité formant colonie par millilitre (CFU/mL). Les valeurs CFU/mL pour chaque point de temps ont été calculées à partir de la plaque de dilution qui contenait 30 à 300 colonies. A partir de la courbe, la phase de latence s'étend jusqu'à environ 2h de croissance, passe à la phase exponentielle de 2h à 7h, puis commence à plafonner, entrant en phase stationnaire. La phase de mort n'est cependant pas une transition brutale, car les UFC/mL commencent progressivement à diminuer après 15 heures, passant d'un pic de 2 x 10 9 à environ 5 x 10 8 à 30 heures.


Figure 5. Courbe de standardisation pour les UFC/mL versus OD600. Une régression linéaire peut être utilisée pour relier ces unités de sorte que la densité optique puisse être utilisée pour approximer la densité cellulaire bactérienne. La densité optique peut être utilisée pour fournir une approximation instantanée du CFU/mL de la culture discontinue. Ici, seuls les six premiers points temporels sont tracés car la relation entre la DO600 et les UFC/mL est moins précise au-delà de 1,0 DO600, car la forme des cellules et les produits extracellulaires commencent à s'accumuler lorsque les bactéries entrent en phase stationnaire, qui se produit peu de temps après avoir atteint 1,0 DO600. Les changements dans la forme des cellules et les produits extracellulaires dans le milieu influencent la lecture de la densité optique et donc la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries dans la culture est également impactée.

Le temps de doublement a également été déterminé à 15 minutes et 19 secondes. A partir de ces données, la capacité de croissance en LB pour E. coli peut être visualisée et être utilisée pour la comparaison entre différents milieux ou bactéries.

Procédure

  1. Matériel de laboratoire requis : milieux liquides, milieux gélosés solidifiés, fioles Erlenmeyer, tubes à essai de 15 ml, solution saline tamponnée au phosphate (PBS), épandeur de cellules bactériennes, éthanol à 70 % et spectrophotomètre. Toutes les solutions et la verrerie doivent être stérilisées avant utilisation.
  2. Préparer le poste de travail en stérilisant avec de l'éthanol à 70 %. Travailler à proximité d'un bec Bunsen pour éviter la contamination des médias.
  3. Lorsque vous travaillez avec des bactéries, un équipement de protection individuelle approprié et une technique aseptique doivent être utilisés.Une blouse de laboratoire et des gants sont nécessaires pour travailler avec des cultures bactériennes.
  4. Recettes pour tampons, solutions et réactifs
    1. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (8).
    2. Bouillon Luria-Bertani (LB) (9).
    1. Préparation des médias
      1. Identifiez les milieux de croissance avec lesquels cultiver les bactéries et préparez des milieux de bouillon liquide et de gélose solide (agar à 1,5 % p/v) dans des bouteilles autoclavables séparées. Ici, le bouillon LB et la gélose LB ont été préparés pour la croissance de Escherichia coli.
      2. Stériliser les médias avec un bouchon semi-serré dans un autoclave réglé à 121 °C pendant 35 min.
      3. Pour les milieux gélosés, après autoclavage, placer dans un bain-marie réglé à 50 °C pendant 30 minutes pour refroidir. Une fois refroidi, verser 20-25 ml de milieu gélosé dans des boîtes de Pétri circulaires de 100x15mm. Laisser les plaques reposer 24 heures à température ambiante avant utilisation.
      1. À partir de stock congelé, rayez les bactéries pour l'isolement sur une gélose de milieu sélectionnée pour obtenir des isolats de colonie unique. Incuber dans des conditions de croissance acceptables pour les bactéries choisies. Ici, E. coli est striée sur gélose LB et est incubée à 37°C pendant une nuit (16-18h).
      2. À l'aide d'une boucle d'inoculation stérile, sélectionnez une seule colonie dans la plaque à stries et inoculez 4 ml de milieu liquide dans un tube à essai de 15 ml et cultivez dans des conditions acceptables pour les bactéries choisies. Ici, E. coli est cultivé à 37°C avec agitation à 210 tr/min pendant la nuit (16-18h).
      1. Préparation des flacons de croissance
        1. Autoclaver des flacons Erlenmeyer de taille appropriée. En règle générale, un rapport de 1:5 entre le milieu et le volume total du flacon est utilisé. Ici, 100 ml de milieu LB sont utilisés dans un flacon de 500 ml.
        2. À l'aide d'une pipette sérologique, transférer les milieux stériles dans l'erlenmeyer.
        1. Étiqueter les tubes à essai de 15 ml : -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 et -9, en distribuant 9 ml de PBS dans chacun. Ces chiffres correspondent au facteur de dilution utilisé pour calculer les UFC/mL. Un nouvel ensemble de tubes est nécessaire pour chaque point de temps de collecte. (Figure 2)
        1. Étiqueter les plaques avec l'heure de collecte et le facteur de dilution. Pour chaque point de temps, il y aura une plaque pour chaque dilution.
        1. Inoculation des milieux
          1. En utilisant la culture liquide d'une nuit préparée dans le cadre de l'étape 2.2.2, inoculer le milieu du flacon avec 1:1000 volume de culture. Ici, 100 µL de culture liquide pendant la nuit sont ajoutés à 100 ml de milieu LB.
          2. Agitez le support pour répartir uniformément les bactéries.
          1. Configuration des conditions de croissance
            1. Placer le flacon dans des conditions de croissance expérimentales choisies pour les bactéries données. Les points de temps doivent être pris fréquemment pour les bactéries à croissance rapide et peuvent être pris à des intervalles plus longs pour les bactéries à croissance lente. Ici, E. coli est cultivé à 37°C avec une agitation à 210 tours par minute (tr/min) et des points de temps pris toutes les 1 heure.
            1. À chaque point de temps, y compris le point de départ (t = 0), prélever 1 ml de culture bactérienne et verser dans une cuvette de spectrophotomètre.
            2. Essuyez la cuvette et enregistrez la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm. Si la lecture de la densité optique est supérieure à 1,0, diluer 100 µL de culture 1:10 avec 900 µL de milieu frais, enregistrer la densité optique et multiplier cette valeur par 10 pour la mesure OD600.
            1. À chaque point de temps, prélever 1 ml de culture bactérienne et verser dans le tube à essai en verre -1 contenant 9 ml de PBS.
            2. Pour la série de dilutions, transférez en série 1 ml du tube -1 dans tous les tubes de dilution jusqu'au -9, en vortexant après chaque transfert. (Figure 2)
            3. Pour chaque dilution, distribuer 100 µL de suspension cellulaire dans la plaque de gélose solide étiquetée en conséquence. (Figure 2)
            4. À l'aide d'un épandeur de cellules qui a été stérilisé à l'éthanol, passé à travers une flamme de bec Bunsen et refroidi en touchant la surface de la gélose, étalez les 100 µL de suspension cellulaire jusqu'à ce que la surface de la plaque de gélose devienne sèche.
            5. Incuber les plaques étalées à l'envers à une température qui favorise la croissance des bactéries. Ici, E. coli est incubé à 37°C.
            6. Après l'incubation, une fois que les colonies visibles apparaissent, comptez le nombre de colonies bactériennes sur chaque plaque et enregistrez ces valeurs ainsi que leur facteur de dilution associé pour toutes les plaques à chaque instant.

            3. Analyse des données et résultats

            1. Tracé de la courbe de croissance de la densité optique (OD600)
              1. Tracez la densité optique (OD600) en fonction du temps sur une échelle semi-log. (figure 3)
              1. Pour chaque point dans le temps, choisissez la plaque de dilution où le nombre de colonies se situe dans la plage de 30 à 300 bactéries. Multipliez le nombre de colonies par le facteur de dilution, puis par 10, car la propagation de 100 µL est considérée comme une dilution supplémentaire de 1:10 lors du calcul des UFC/mL.
              2. Tracez les unités formant colonie en fonction du temps sur une échelle semi-logarithmique. (Figure 4)
              1. Tracez les unités formant colonie en fonction de la densité optique sur une échelle linéaire pour les lectures de DO600 inférieures ou égales à 1,0 DO600 car la relation entre DO600 et CFU/mL est moins précise au-delà de 1,0 DO600. Ici, les six premiers points temporels sont tracés. (Figure 5)
              2. Générez une courbe de tendance de régression linéaire affichant l'équation et la valeur R2.
              1. En utilisant le tracé de la courbe de croissance de l'unité formant colonie, pendant la phase exponentielle, identifiez deux points sur le graphique avec la pente la plus raide entre eux pour calculer le temps de doublement.
              2. Calcul du temps de doublement
                1. ΔHeure = t2 - t1, où t1 = Point de temps 1 et t2 = Point de temps 2
                2. , où b = nombre de bactéries à t2, B = nombre de bactéries à t1, et m = nombre de générations. Dérivé de: .
                3. Calculer le temps de doublement en utilisant :

                Les bactéries se reproduisent par un processus appelé division cellulaire, qui donne deux cellules filles identiques. Si les conditions de croissance sont favorables, les populations bactériennes croîtront de façon exponentielle.

                Les courbes de croissance bactérienne tracent la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps. Une courbe de croissance typique passe par quatre étapes : phase de latence, phase exponentielle, phase stationnaire et phase de mort. La phase de latence est le temps qu'il faut aux bactéries pour atteindre un état où elles peuvent se développer et se diviser rapidement. Après cela, les bactéries passent à la phase exponentielle, caractérisée par une croissance et une division cellulaires rapides. Le taux de croissance exponentielle de la culture bactérienne au cours de cette phase peut être exprimé comme le temps de doublement, le taux le plus rapide auquel les bactéries peuvent se reproduire dans des conditions spécifiques. La phase stationnaire vient ensuite, où la croissance des cellules bactériennes atteint un plateau et les taux de croissance et de mortalité s'égalisent en raison de l'épuisement des nutriments environnementaux. Enfin, la bactérie entre dans la phase de mort. C'est là que la croissance bactérienne diminue fortement et qu'un épuisement sévère des nutriments conduit à la lyse des cellules.

                Deux techniques peuvent être utilisées pour quantifier la quantité de bactéries présentes dans une culture et tracer une courbe de croissance. Le premier d'entre eux se fait via des unités formant des colonies, ou UFC. Pour obtenir des UFC, une à dix séries de neuf dilutions sont effectuées à des moments réguliers. La première de ces dilutions, négative dans cet exemple, contient 9mL de PBS et 1mL de la culture bactérienne. Il en résulte un facteur de dilution de 1:10. Ensuite, 1 ml de cette solution est transféré dans le tube suivant, négatif deux, ce qui donne un facteur de dilution de 1:100. Ce processus se poursuit à travers le dernier tube, négatif neuf, ce qui donne un facteur de dilution final de 1:1 milliard. Après cela, 100 microlitres de chaque dilution sont étalés. Les plaques sont ensuite incubées et les colonies clonales sont comptées. La plaque de dilution pour un moment donné qui se développe entre 30 et 300 colonies est utilisée pour calculer les UFC par millilitre pour ce moment.

                La deuxième méthode courante de mesure de la concentration bactérienne est la densité optique. La densité optique d'une culture peut être mesurée instantanément, en relation avec un milieu à blanc, avec un spectrophotomètre. Généralement, une longueur d'onde de 600 nanomètres, également appelée OD600, est utilisée pour ces mesures, qui augmentent à mesure que la densité cellulaire augmente. Bien que la densité optique soit moins précise que les UFC, elle est pratique car elle peut être obtenue instantanément et nécessite relativement peu de réactifs. Les deux techniques peuvent être utilisées ensemble pour créer une courbe standard qui se rapproche plus précisément du nombre de cellules bactériennes d'une culture. Dans cette vidéo, vous apprendrez comment obtenir des mesures CFU et OD600 à partir de dilutions en série chronométrées de E. coli. Ensuite, deux courbes de croissance utilisant les mesures CFU et OD600, respectivement, seront tracées avant d'être reliées par une courbe standard.

                Lorsque vous travaillez avec des bactéries, il est important d'utiliser l'équipement de protection individuelle approprié, comme une blouse de laboratoire et des gants, et d'observer une technique d'asepsie appropriée.

                Après cela, stérilisez le poste de travail avec de l'éthanol à 70 %. Tout d'abord, préparez le bouillon LB et les milieux de gélose solide LB dans des bouteilles autoclavables séparées. Après avoir partiellement fermé les bouchons des bouteilles, stérilisez les milieux dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant 35 minutes. Ensuite, laissez les milieux gélosés refroidir dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois refroidi, verser 20 à 25 mL dans chaque boîte de Pétri. Après cela, laissez les plaques reposer pendant 24 heures à température ambiante.

                Pour préparer les isolats d'une seule colonie qui seront ensuite utilisés pour produire une culture bactérienne liquide, utilisez un stock préalablement congelé et une technique de placage par stries appropriée pour strier E. coli pour l'isolement sur gélose LB. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après cela, refroidir une boucle d'inoculation stérilisée à la flamme sur la gélose avant de sélectionner une seule colonie de la plaque striée. Inoculer 4 ml de milieu liquide dans un tube à essai de 15 ml. Ensuite, faites pousser le E. coli à 37 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation à 210 tr/min.

                Pour mettre en place le volume 1:1000 de culture bactérienne qui sera utilisé dans la courbe de croissance, obtenez d'abord un flacon Erlenmeyer de 500 ml autoclavé. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 50 ml pour transférer 100 ml de milieu stérile dans le flacon. Ensuite, étiquetez neuf tubes à essai de 15 ml consécutivement de un à neuf. Ces nombres correspondent au facteur de dilution qui sera utilisé pour calculer l'unité formant colonie, ou UFC. Ensuite, ajoutez 9 ml de PBS 1X dans chaque tube. Après cela, étiquetez les plaques de gélose préparées avec les points de temps correspondants et les facteurs de dilution qui seront cultivés. Dans cet exemple avec E. coli, après le point de départ, les points de temps sont pris une fois toutes les heures. Utilisation du liquide de nuit préalablement préparé E. coli culture, ensemencer les milieux dans l'autoclave erlenmeyer de 500 mL avec 1:1000 volume de culture. Agitez le support pour répartir uniformément les bactéries.

                Après avoir effacé un spectrophotomètre, nettoyez la cuvette avec une lingette non pelucheuse. Ensuite, versez 1 ml de la culture dans la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre pour obtenir la densité optique de la culture au point zéro. Ensuite, faites pousser le E. coli à 37 degrés Celsius avec agitation à 210 tr/min. À chaque point de temps après le point de temps zéro, retirez encore 1 ml de culture bactérienne du flacon et répétez la mesure de la densité optique. Si la lecture de la densité optique est supérieure à 1,0, diluer 100 microlitres de culture bactérienne avec 900 microlitres de milieu frais, puis mesurer à nouveau la densité optique. Cette valeur peut être multipliée par 10 pour la mesure OD 600.

                Pour obtenir la mesure de l'unité formant colonie pour chaque point dans le temps, prélevez 1 ml supplémentaire de culture bactérienne du flacon à chaque point dans le temps. Distribuer la culture bactérienne dans le tube à essai négatif et mélanger au vortex. Ensuite, effectuez la série de dilutions en transférant d'abord 1 ml du tube négatif un dans le tube négatif deux et vortex pour mélanger. Transférer 1 ml du tube négatif deux dans le tube négatif trois et vortexer pour mélanger. Continuez ce transfert en série dans tous les tubes de dilution jusqu'au tube négatif neuf. Distribuer 100 microlitres de suspension cellulaire sur la plaque étiquetée en conséquence pour chaque dilution. Pour chaque dilution, stérilisez un épandeur de cellules dans de l'éthanol, passez-le à travers une flamme de bec Bunsen et refroidissez-le en touchant la surface de la gélose loin de l'inoculat. Ensuite, utilisez l'épandeur de cellules pour étaler la suspension cellulaire jusqu'à ce que la surface de la plaque de gélose devienne sèche. Incuber les plaques à l'envers à 37 degrés Celsius. Une fois que les colonies visibles apparaissent, comptez le nombre de colonies bactériennes sur chaque plaque. Enregistrer ces valeurs et leurs facteurs de dilution associés pour chaque plaque à chaque instant.

                Pour créer une courbe de croissance OD 600, après vous être assuré que tous les points de données sont entrés correctement dans un tableau, sélectionnez tous les points de temps et leurs données correspondantes. Pour générer un graphique de la courbe de croissance de l'unité formant colonie, choisissez la plaque de dilution où le nombre de colonies se situe dans la plage de 30 à 300 bactéries pour chaque point dans le temps. Multipliez le nombre de colonies par le facteur de dilution, puis par dix. En effet, l'étalement de 100 microlitres est considéré comme une dilution supplémentaire de 1:10 lors du calcul des unités formant colonie par millilitre. Après cela, tracez les unités formant la colonie en fonction du temps sur une échelle semi-logarithmique.

                Ces parcelles produites avec les mesures OD 600 et CFU, respectivement, peuvent fournir des informations précieuses sur E. coli cinétique de croissance. La densité optique et les unités de formation de colonies peuvent être liées, de sorte que les UFC par millilitre peuvent être estimées à partir des mesures de la DO 600, ce qui permet d'économiser du temps et des matériaux dans les expériences futures.

                Pour ce faire, tracez les unités formant colonie en fonction de la densité optique sur une échelle linéaire pour des lectures de DO 600 inférieures ou égales à 1. 0. Après cela, générez une ligne de tendance de régression linéaire au format Y = MX + B, où M est la pente et B est l'ordonnée à l'origine. Faites un clic droit sur les points de données et sélectionnez Ajouter une ligne de tendance et linéaire. Ensuite, cochez la case pour afficher l'équation sur le graphique et afficher la valeur R au carré sur le graphique. La valeur R au carré est la mesure statistique du degré de correspondance des données avec la droite de régression ajustée. Dans cet exemple, les 6 premiers points temporels sont tracés avec une DO 600 sur l'axe des x et des UFC par millilitre sur l'axe des y. Dans les expériences futures avec les mêmes conditions de croissance, ces valeurs de pente et d'ordonnée à l'origine peuvent être connectées à cette équation pour estimer les UFC à partir des lectures OD 600. Ensuite, regardez le tracé de la courbe de croissance de l'unité formant colonie. Pendant la phase exponentielle, identifiez deux points dans le temps avec la pente la plus raide entre eux. Pour calculer le temps de doublement, calculez d'abord le changement de temps entre les points temporels sélectionnés. Ensuite, calculez le changement de générations en utilisant l'équation montrée ici. Ici, la minuscule b est le nombre de bactéries au point de temps trois et la majuscule B est le nombre de bactéries au point de temps deux. Enfin, divisez le changement dans le temps par le changement dans les générations. Dans cet exemple, le temps de doublement est de 0,26 heures ou 15 minutes et 19 secondes. La comparaison des temps de doublement entre différents traitements expérimentaux nous permet d'identifier les meilleures conditions de croissance pour une certaine espèce bactérienne. Par conséquent, le traitement avec le temps de doublement le plus faible sera le plus optimal des conditions testées.

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                Résultats

                Les parcelles d'unités formant des colonies et la densité optique sont deux façons de visualiser la cinétique de croissance. En déterminant la relation entre les UFC/mL et la DO600, le tracé de la densité optique fournit également une estimation des UFC/mL au fil du temps. Les conditions qui entraînent le temps de doublement le plus court sont considérées comme optimales pour la croissance des bactéries données.

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                Applications et résumé

                Les courbes de croissance sont précieuses pour comprendre la cinétique de croissance et la physiologie des bactéries. Ils nous permettent de déterminer comment les bactéries répondent dans des conditions de croissance variables ainsi que de définir les paramètres de croissance optimaux pour une bactérie donnée. L'unité formant colonie et les parcelles de densité optique contiennent toutes deux des informations précieuses décrivant la durée de la phase de latence, la densité cellulaire maximale atteinte et permettant le calcul du temps de doublement bactérien. Les courbes de croissance permettent également de comparer différentes bactéries dans les mêmes conditions de croissance. De plus, la densité optique fournit un moyen de standardiser les inoculums initiaux, améliorant ainsi la cohérence dans d'autres expériences.

                La détermination de l'approche à utiliser lors de la conception d'une expérience de courbe de croissance doit être prise en compte. En tant que méthode préférée pour générer des courbes de croissance, les parcelles d'unités formant des colonies reflètent plus précisément le nombre de cellules viables dans la culture par lots. Les parcelles d'unités formant des colonies permettent également de mesurer la croissance bactérienne dans des conditions qui interféreraient autrement avec une mesure de densité optique. Cependant, il s'agit d'un processus plus long, nécessitant une utilisation intensive de réactifs, et doit être effectué manuellement. Les graphiques de densité optique sont moins précis et ne fournissent qu'une estimation des unités formant colonie, nécessitant la génération d'une courbe standard pour chaque bactérie unique. La densité optique est principalement utilisée pour sa commodité car elle prend beaucoup moins de temps et ne nécessite pas beaucoup de réactifs pour fonctionner. Ce qui est le plus intéressant pour la densité optique, c'est que les incubateurs spectrophotométriques peuvent générer automatiquement des courbes de croissance, augmentant considérablement le nombre de conditions de culture pouvant être testées en même temps et éliminant le besoin d'assister constamment à la culture.

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                Les références

                1. R.E. Buchanan. 1918. Phases de la vie dans une culture bactérienne. J Infect Dis 23:109-125.
                2. CAMPBELL A. 1957. Synchronisation de la division cellulaire. Bactériol Rev 21:263-72.
                3. Wang P, Robert L, Pelletier J, Dang WL, Taddei F, Wright A, Jun S. 2010. Croissance robuste d'Escherichia coli. Curr Biol 20:1099-103.
                4. Goldman E, Green LH. 2015. Manuel pratique de microbiologie, troisième édition. Presse CRC.
                5. Ben-David A, Davidson CE. 2014. Méthode d'estimation pour les expériences de dilution en série. J Microbiol Methods 107:214-221.
                6. Koch AL. 1968. Théorie de la dépendance angulaire de la lumière diffusée par des bactéries et des objets biologiques de taille similaire. J Theor Biol 18:133-156.
                7. Sezonov G, Joseleau-Petit D, D&# 39Ari R. 2007. Physiologie d'Escherichia coli dans le bouillon Luria-Bertani. J Bactériol 189:8746-9.

                Transcription

                Les bactéries se reproduisent par un processus appelé division cellulaire, qui donne deux cellules filles identiques. Si les conditions de croissance sont favorables, les populations bactériennes croîtront de façon exponentielle.

                Les courbes de croissance bactérienne tracent la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps. Une courbe de croissance typique passe par quatre étapes : phase de latence, phase exponentielle, phase stationnaire et phase de mort. La phase de latence est le temps qu'il faut aux bactéries pour atteindre un état où elles peuvent se développer et se diviser rapidement. Après cela, les bactéries passent à la phase exponentielle, caractérisée par une croissance et une division cellulaires rapides. Le taux de croissance exponentielle de la culture bactérienne au cours de cette phase peut être exprimé comme le temps de doublement, le taux le plus rapide auquel les bactéries peuvent se reproduire dans des conditions spécifiques. La phase stationnaire vient ensuite, où la croissance des cellules bactériennes atteint un plateau et les taux de croissance et de mortalité s'égalisent en raison de l'épuisement des nutriments environnementaux. Enfin, la bactérie entre dans la phase de mort. C'est là que la croissance bactérienne diminue fortement et qu'un épuisement sévère des nutriments conduit à la lyse des cellules.

                Deux techniques peuvent être utilisées pour quantifier la quantité de bactéries présentes dans une culture et tracer une courbe de croissance. Le premier d'entre eux se fait via des unités formant des colonies, ou UFC. Pour obtenir des UFC, une à dix séries de neuf dilutions sont effectuées à des moments réguliers.La première de ces dilutions, négative dans cet exemple, contient 9mL de PBS et 1mL de la culture bactérienne. Il en résulte un facteur de dilution de 1:10. Ensuite, 1 ml de cette solution est transféré dans le tube suivant, négatif deux, ce qui donne un facteur de dilution de 1:100. Ce processus se poursuit à travers le dernier tube, négatif neuf, ce qui donne un facteur de dilution final de 1:1 milliard. Après cela, 100 microlitres de chaque dilution sont étalés. Les plaques sont ensuite incubées et les colonies clonales sont comptées. La plaque de dilution pour un moment donné qui se développe entre 30 et 300 colonies est utilisée pour calculer les UFC par millilitre pour ce moment.

                La deuxième méthode courante de mesure de la concentration bactérienne est la densité optique. La densité optique d'une culture peut être mesurée instantanément, en relation avec un milieu à blanc, avec un spectrophotomètre. Généralement, une longueur d'onde de 600 nanomètres, également appelée OD600, est utilisée pour ces mesures, qui augmentent à mesure que la densité cellulaire augmente. Bien que la densité optique soit moins précise que les UFC, elle est pratique car elle peut être obtenue instantanément et nécessite relativement peu de réactifs. Les deux techniques peuvent être utilisées ensemble pour créer une courbe standard qui se rapproche plus précisément du nombre de cellules bactériennes d'une culture. Dans cette vidéo, vous apprendrez comment obtenir des mesures CFU et OD600 à partir de dilutions en série chronométrées d'E. coli. Ensuite, deux courbes de croissance utilisant les mesures CFU et OD600, respectivement, seront tracées avant d'être reliées par une courbe standard.

                Lorsque vous travaillez avec des bactéries, il est important d'utiliser l'équipement de protection individuelle approprié, comme une blouse de laboratoire et des gants, et d'observer une technique d'asepsie appropriée.

                Après cela, stérilisez le poste de travail avec de l'éthanol à 70 %. Tout d'abord, préparez le bouillon LB et les milieux de gélose solide LB dans des bouteilles autoclavables séparées. Après avoir partiellement fermé les bouchons des bouteilles, stérilisez les milieux dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant 35 minutes. Ensuite, laissez les milieux gélosés refroidir dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois refroidi, verser 20 à 25 mL dans chaque boîte de Pétri. Après cela, laissez les plaques reposer pendant 24 heures à température ambiante.

                Pour préparer les isolats de colonie unique qui seront ensuite utilisés pour produire une culture bactérienne liquide, utilisez un stock préalablement congelé et une technique de placage par stries appropriée pour strier E. coli pour l'isolement sur gélose LB. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après cela, refroidir une boucle d'inoculation stérilisée à la flamme sur la gélose avant de sélectionner une seule colonie de la plaque striée. Inoculer 4 ml de milieu liquide dans un tube à essai de 15 ml. Ensuite, faites pousser E. coli à 37 degrés Celsius pendant la nuit en secouant à 210 tr/min.

                Pour mettre en place le volume 1:1000 de culture bactérienne qui sera utilisé dans la courbe de croissance, obtenez d'abord un flacon Erlenmeyer de 500 ml autoclavé. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 50 ml pour transférer 100 ml de milieu stérile dans le flacon. Ensuite, étiquetez neuf tubes à essai de 15 ml consécutivement de un à neuf. Ces nombres correspondent au facteur de dilution qui sera utilisé pour calculer l'unité formant colonie, ou UFC. Ensuite, ajoutez 9 ml de PBS 1X dans chaque tube. Après cela, étiquetez les plaques de gélose préparées avec les points de temps correspondants et les facteurs de dilution qui seront cultivés. Dans cet exemple avec E. coli, après le point de départ, les points de temps sont pris une fois par heure. En utilisant la culture liquide d'E. coli pendant la nuit préalablement préparée, ensemencer le milieu dans l'autoclave erlenmeyer de 500 ml avec 1:1000 volume de culture. Agitez le support pour répartir uniformément les bactéries.

                Après avoir effacé un spectrophotomètre, nettoyez la cuvette avec une lingette non pelucheuse. Ensuite, versez 1 ml de la culture dans la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre pour obtenir la densité optique de la culture au point zéro. Ensuite, faites pousser E. coli à 37 degrés Celsius en secouant à 210 tr/min. À chaque point de temps après le point de temps zéro, retirez encore 1 ml de culture bactérienne du flacon et répétez la mesure de la densité optique. Si la lecture de la densité optique est supérieure à 1,0, diluer 100 microlitres de culture bactérienne avec 900 microlitres de milieu frais, puis mesurer à nouveau la densité optique. Cette valeur peut être multipliée par 10 pour la mesure OD 600.

                Pour obtenir la mesure de l'unité formant colonie pour chaque point dans le temps, prélevez 1 ml supplémentaire de culture bactérienne du flacon à chaque point dans le temps. Distribuer la culture bactérienne dans le tube à essai négatif et mélanger au vortex. Ensuite, effectuez la série de dilutions en transférant d'abord 1 ml du tube négatif un dans le tube négatif deux et vortex pour mélanger. Transférer 1 ml du tube négatif deux dans le tube négatif trois et vortexer pour mélanger. Continuez ce transfert en série dans tous les tubes de dilution jusqu'au tube négatif neuf. Distribuer 100 microlitres de suspension cellulaire sur la plaque étiquetée en conséquence pour chaque dilution. Pour chaque dilution, stérilisez un épandeur de cellules dans de l'éthanol, passez-le à travers une flamme de bec Bunsen et refroidissez-le en touchant la surface de la gélose loin de l'inoculat. Ensuite, utilisez l'épandeur de cellules pour étaler la suspension cellulaire jusqu'à ce que la surface de la plaque de gélose devienne sèche. Incuber les plaques à l'envers à 37 degrés Celsius. Une fois que les colonies visibles apparaissent, comptez le nombre de colonies bactériennes sur chaque plaque. Enregistrer ces valeurs et leurs facteurs de dilution associés pour chaque plaque à chaque instant.

                Pour créer une courbe de croissance OD 600, après vous être assuré que tous les points de données sont entrés correctement dans un tableau, sélectionnez tous les points de temps et leurs données correspondantes. Pour générer un graphique de la courbe de croissance de l'unité formant colonie, choisissez la plaque de dilution où le nombre de colonies se situe dans la plage de 30 à 300 bactéries pour chaque point dans le temps. Multipliez le nombre de colonies par le facteur de dilution, puis par dix. En effet, l'étalement de 100 microlitres est considéré comme une dilution supplémentaire de 1:10 lors du calcul des unités formant colonie par millilitre. Après cela, tracez les unités formant la colonie en fonction du temps sur une échelle semi-logarithmique.

                Ces parcelles produites avec des mesures de DO 600 et CFU, respectivement, peuvent fournir des informations précieuses sur la cinétique de croissance d'E. coli. La densité optique et les unités de formation de colonies peuvent être liées, de sorte que les UFC par millilitre peuvent être estimées à partir des mesures de la DO 600, ce qui permet d'économiser du temps et des matériaux dans les expériences futures.

                Pour ce faire, tracez les unités formant colonie en fonction de la densité optique sur une échelle linéaire pour des lectures de DO 600 inférieures ou égales à 1. 0. Après cela, générez une ligne de tendance de régression linéaire au format Y = MX + B, où M est la pente et B est l'ordonnée à l'origine. Faites un clic droit sur les points de données et sélectionnez Ajouter une ligne de tendance et linéaire. Ensuite, cochez la case pour afficher l'équation sur le graphique et afficher la valeur R au carré sur le graphique. La valeur R au carré est la mesure statistique du degré de correspondance des données avec la droite de régression ajustée. Dans cet exemple, les 6 premiers points temporels sont tracés avec une DO 600 sur l'axe des x et des UFC par millilitre sur l'axe des y. Dans les expériences futures avec les mêmes conditions de croissance, ces valeurs de pente et d'ordonnée à l'origine peuvent être connectées à cette équation pour estimer les UFC à partir des lectures OD 600. Ensuite, regardez le tracé de la courbe de croissance de l'unité formant colonie. Pendant la phase exponentielle, identifiez deux points dans le temps avec la pente la plus raide entre eux. Pour calculer le temps de doublement, calculez d'abord le changement de temps entre les points temporels sélectionnés. Ensuite, calculez le changement de générations en utilisant l'équation montrée ici. Ici, la minuscule b est le nombre de bactéries au point de temps trois et la majuscule B est le nombre de bactéries au point de temps deux. Enfin, divisez le changement dans le temps par le changement dans les générations. Dans cet exemple, le temps de doublement est de 0,26 heures ou 15 minutes et 19 secondes. La comparaison des temps de doublement entre différents traitements expérimentaux nous permet d'identifier les meilleures conditions de croissance pour une certaine espèce bactérienne. Par conséquent, le traitement avec le temps de doublement le plus faible sera le plus optimal des conditions testées.


                4. DISCUSSION

                Depuis son émergence en décembre 2019, le SARS-CoV-2 est devenu une pandémie mondiale. Bien que des mesures de santé publique aient été prises, aucun médicament ou vaccin efficace n'a encore été développé. Les vaccins sous-unitaires, qui sont l'une des deux formes de vaccins les plus couramment adoptées sur le marché, sont plus sûrs que les vaccins à virion entier en raison du risque réduit d'exposition pendant la fabrication.

                Les protéines de pointe (S), qui se trouvent à la surface des particules de coronavirus, sont responsables de l'entrée dans les cellules hôtes et sont largement considérées comme des cibles prophylactiques et thérapeutiques. 12, 14 Semblable aux résultats utilisant des vaccins à virus entier inactivés, les rapports d'immunopathologie montrent une infiltration éosinophile et des lésions alvéolaires inflammatoires médiées par Th2 lorsque les souris sont confrontées à un virus infectieux après immunisation avec des protéines S complètes. 31-35 Pour réduire ce risque, les segments de protéine S ont été évalués en tant qu'antigènes vaccinaux sous-unitaires. Alors que le domaine S2, qui contient deux segments répétés d'heptades, participe à la fusion membranaire virus-cellule et est une cible potentielle pour le développement d'inhibiteurs antiviraux, le domaine S1, qui contient le RBD, est responsable de la fixation aux récepteurs de l'hôte (SRAS- CoV-1&-2 avec l'enzyme humaine de conversion de l'angiotensine 2 et le MERS-CoV avec la dipeptidyl peptidase-4) humaine et a été largement accepté comme cible pour le développement de vaccins contre le SRAS-CoV-1 et le MERS-CoV. 13, 36-41

                Le SARS-CoV-2 RBD seul n'est pas aussi immunogène que S1, comme en témoignent les titres d'IgG (figure 2B) et d'IgA (figure 2C) spécifiques à S1 et spécifiques à RBD induits dans le sérum de souris immunisé. Ce phénomène peut être attribué en partie à la taille plus petite du RBD (223 aa) que du S1 (670 aa). En fait, lorsque le RBD a été ligaturé au domaine de l'enveloppe du norovirus (pour un poids moléculaire total d'environ 52 kDa), les titres IgG et IgA spécifiques à S1 et spécifiques à RBD étaient élevés de manière proéminente (Figure 2B, C). Des rapports antérieurs ont démontré que l'immunogénicité du RBD peut être améliorée via la présentation sur des particules pseudo-virales (VLP) et la multimérisation des monomères RBD. 42, 43 Nous avions initialement l'intention d'améliorer l'immunogénicité du RBD via une présentation sur le domaine de l'enveloppe du norovirus, mais malheureusement, ni les protéines recombinantes S-RBD ni S-S1 n'ont formé de VLP typiques (figure 1) comme prévu. 23, 24 Nous ne savons pas si ces résultats doivent être attribués aux caractéristiques du RBD et du S1 ou aux difficultés de reconfiguration des organismes d'inclusion.

                À notre grande surprise, bien que S1 et S-S1 aient induit des titres d'IgG et d'IgA spécifiques à S1 comparables (Figure 2), seul le sérum de souris immunisé par S1 a montré une neutralisation importante du SRAS-CoV-2 (Figure 4). Ce schéma a également été observé avec du sérum de souris immunisé par RBD et S-RBD. Ces résultats impliquent que les spectres d'anticorps induits par RBD et S1 à partir de différents systèmes d'expression sont assez différents. Par rapport aux cellules procaryotes, les systèmes d'expression des mammifères incorporent efficacement les modifications post-traductionnelles RBD et S-RBD, y compris la glycosylation, qui pourraient être critiques pour la configuration naturelle de ces protéines. 44 A l'inverse, les organismes d'inclusion produits par E. coli les cellules peuvent augmenter les difficultés de reconfiguration. Quelle que soit la vérité, ces résultats démontrent que les anticorps neutralisants dépendants de la conformation induits par les protéines S1 immunisées jouent un rôle clé dans la neutralisation du virus et une protection efficace ultérieure. 20, 45 Comme les titres d'IgG et d'IgA spécifiques de RBD induits par S1 sont très faibles et que des titres similaires induits par RBD n'ont montré aucune neutralisation importante, nous avons déduit que d'autres domaines S1 en plus du RBD sont également des antigènes très importants pour l'induction d'anticorps neutralisants.

                Notamment, ces anticorps non neutralisants peuvent inhiber la neutralisation. Comme cela a été observé dans la dengue, le virus respiratoire syncytial, etc., des phénomènes d'infection ADE ont également été signalés avec des anticorps contre les protéines de pointe du SARS-CoV-1 et du MERS-CoV (y compris des anticorps contre le RBD). 46-48 Il est intéressant de noter que les sérums inducteurs d'ADE ne contenaient pas d'anticorps de sous-type IgG2a spécifiques au pic du SRAS-CoV-1, qui sont présents dans les sérums neutralisants. 49 Ce résultat est cohérent avec l'infiltration éosinophile observée après la vaccination et l'exposition au virus, une caractéristique typique des réponses immunitaires Th2 avec des proportions élevées d'IgG1/IgG2a. 28, 29 Malheureusement, le SARS-CoV-2 S1 et le RBD ont tous deux montré une réponse immunitaire de type Th2 avec des proportions élevées d'IgG1 lorsqu'ils étaient immunisés avec de l'alun comme adjuvant (Figure 3), impliquant un risque immunopathologique similaire à ceux signalés pour d'autres coronavirus. Bien qu'aucun EIM n'ait été signalé dans les modèles animaux réexposés au SRAS-CoV-2 ou exposés après la vaccination vaccinale, une attention particulière doit être accordée aux adjuvants biaisés Th1, comme indiqué dans le développement du SARS-CoV-1 et du MERS-CoV vaccins. 31, 32

                En conclusion, le domaine SARS-CoV-2 S1 est plus immunogène que le domaine RBD, induisant des anticorps IgG et IgA plus élevés ainsi que des anticorps de neutralisation virale efficaces. Nous en déduisons qu'une grande proportion de ces épitopes de neutralisation existent dans le domaine S1 mais en dehors du RBD et que certains d'entre eux sont des épitopes spatiaux. Alors que S1 a induit une réponse Th1/Th2 plus équilibrée que le RBD lorsqu'il est adjuvé avec de l'alun, des niveaux accrus d'anticorps IgG1 indiquent toujours un risque potentiel d'EIM, et les adjuvants sujets à une réponse Th1 doivent être envisagés pour les vaccins COVID-19 basés sur la sous-unité S1. .


                Voir la vidéo: Dilution Series u0026 Serial Dilution (Janvier 2022).