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L'inhibiteur enzymatique conduit à un taux de renouvellement plus élevé?


Je travaille actuellement sur un projet où je dois m'occuper de l'inhibition enzymatique. L'enzyme purifiée montre un bon renouvellement du substrat. Cependant, lorsque j'essaie de l'inhiber avec différents inhibiteurs décrits dans la littérature, je reçois des résultats assez maladroits.

J'ai maintenant testé 3 composés inhibiteurs différents. L'un a montré de bons résultats (il a réduit le renouvellement du substrat), tandis que les deux autres composés ont plutôt conduit à une augmentation du renouvellement du substrat ?!

Je sais que cela semble ridicule, mais quelqu'un a-t-il déjà vécu quelque chose comme ça? Les mesures des composés "fonctionnant" et "non fonctionnel" ont lieu sur la même plaque. Comment se fait-il que des inhibiteurs largement décrits conduisent à de tels résultats ?


Bien qu'il soit difficile de savoir exactement ce qui ne va pas dans le laboratoire de quelqu'un d'autre, des effets apparemment paradoxaux comme ceux-ci sont malheureusement courants dans le travail de laboratoire. En supposant qu'il s'agisse effectivement d'inhibiteurs bien établis qui devraient vraiment fonctionner, voyons pourquoi ils pourraient ne pas être entre vos mains.

Les mécanismes d'interaction moléculaire sont suffisamment complexes pour qu'il existe de nombreux cas où une substance qui agit comme activateur dans une condition peut agir comme inhibiteur dans une autre condition. Une autre façon de voir un tel effet est si votre système purifié n'est pas aussi bon que vous le pensez et que le problème est partiellement soulagé par l'un des inhibiteurs, par exemple, imparfaitement purifié et que l'ajout de l'inhibiteur neutralise certaines des imperfections.

Ne connaissant pas les détails des composés avec lesquels vous travaillez, il n'est pas possible de deviner laquelle des possibilités pourrait être à l'œuvre. Je suggère cependant que vous commenciez par :

  1. Comparer votre taux de renouvellement quantitatif avec l'enzyme purifiée au taux prédit de la littérature pour voir si votre système de base fonctionne réellement correctement.
  2. Assurez-vous que votre système traite également (ne) pas le substrat à la faible vitesse appropriée lorsque l'enzyme est absente.
  3. Vérifier les différences potentielles entre votre méthode et la méthode que vous essayez d'adapter à partir de la littérature, ce qui pourrait donner des indices sur les différences de condition qui peuvent avoir un impact sur vos résultats.

Comment étudier l'inhibition compétitive. Cela se fait généralement comme suit. On effectue d'abord un ensemble de réactions V vs. [S] sans inhibiteur (20 tubes environ, avec tampon et quantités constantes d'enzyme, quantités variables de substrat, temps de réaction égaux). V vs. [S] est tracé, ainsi que 1/V vs. 1/[S], ​​si vous le souhaitez. Ensuite, une deuxième série de réactions est effectuée de la même manière que précédemment, sauf qu'une quantité fixe de l'inhibiteur de méthotrexate est ajoutée à chaque tube. À de faibles concentrations de substrat, l'inhibiteur rivalise efficacement pour l'enzyme, mais à des concentrations élevées de substrat, l'inhibiteur aura un effet très réduit, car le substrat le surpasse, en raison de sa concentration plus élevée (rappelez-vous que l'inhibiteur est à concentration fixe ). Graphiquement, les résultats de ces expériences sont présentés ci-dessus. Notez qu'à des concentrations élevées de substrat, l'inhibiteur compétitif n'a pratiquement aucun effet, ce qui fait que la Vmax de l'enzyme reste inchangée. Pour réitérer, cela est dû au fait qu'à des concentrations élevées de substrat, l'inhibiteur ne rivalise pas bien. Cependant, à des concentrations de substrat plus faibles, c'est le cas.

Notez que le KM apparent de l'enzyme pour le substrat augmente (-1/KM se rapproche de zéro - ligne rouge ci-dessus) lorsque l'inhibiteur est présent, illustrant ainsi la meilleure compétition de l'inhibiteur à des concentrations de substrat plus faibles. Il n'est peut-être pas évident de savoir pourquoi nous appelons le KM modifié le KM apparent de l'enzyme. La raison en est que l'inhibiteur ne modifie pas réellement l'affinité de l'enzyme pour le substrat de folate. Il semble seulement le faire. C'est à cause de la façon dont fonctionne l'inhibition compétitive. Lorsque l'inhibiteur compétitif se lie à l'enzyme, celui-ci est effectivement "hors d'action". Les enzymes inactives n'ont AUCUNE affinité pour le substrat et aucune activité non plus. Nous pouvons mesurer le KM pour une enzyme inactive.

Les molécules enzymatiques qui ne sont pas liées par le méthotrexate peuvent, en effet, se lier au folate et sont actives. Le méthotrexate n'a aucun effet sur eux et leurs valeurs KM sont inchangées. Pourquoi alors, le KM semble-t-il plus élevé en présence d'un inhibiteur compétitif. La raison en est que l'inhibiteur compétitif réduit la quantité d'enzyme active à des concentrations plus faibles de substrat. Lorsque la quantité d'enzyme est réduite, il faut avoir plus de substrat pour fournir suffisamment la quantité réduite d'enzyme pour atteindre Vmax/2.

Il est à noter que dans l'inhibition compétitive, le pourcentage de
l'enzyme inactive change radicalement sur la plage des valeurs [S]
utilisé. Pour commencer, aux faibles valeurs [S], le plus grand pourcentage de la
l'enzyme est inhibée. À [S] élevé, aucun pourcentage significatif de
l'enzyme est inhibée. Ce n'est pas toujours le cas, comme nous le verrons
en inhibition non compétitive.


Réactions enzymatiques : discussion et résultats

Tableau 1. Concentrations, volumes et observations des solutions pour l'expérience 1 : Observation de la réaction enzymatique.

Tube à essaidH2Extrait de pomme de terrecatécholObservations
15 ml + 500μl—–500μLLa solution a viré au blanc laiteux pour devenir limpide. (Substrat élevé)
25 ml500μl500μlLa solution a viré au brun jaunâtre. (Substrat élevé)
35 ml + 500μl500μl—–La solution est claire, mais blanc trouble au fond. (Zéro substrat)

*La réaction chimique a été observée avec l'introduction de catéchol dans l'extrait de pomme de terre (tube 2).

Tableau 2. Concentrations de solution, volumes et observations pour l'expérience 2 : L'effet de la concentration de substrat sur l'activité enzymatique.

Tube à essaidH2Extrait de pomme de terrecatécholObservations
15 ml + 500μl500μl500μLLa solution est devenue claire, brun jaunâtre. (Substrat élevé)
25 ml + 900μl500μl100μlSolution devenue pêche translucide. (Faible substrat, dilué)

*Le temps de réaction pour le tube 1 était le plus rapide en raison de la concentration élevée en substrat et du dH inférieur20 concentration.

Tableau 3. Concentrations, volumes et observations de solution pour l'expérience 3 : L'effet de la concentration enzymatique sur l'activité enzymatique.

Tube à essaidH2Extrait de pomme de terrecatécholObservations
15 ml + 500μl500μl500μLLa solution est passée du vert bleuâtre au brun jaunâtre clair. (Substrat élevé)
25 ml + 900μl100μl500μlLégèrement plus trouble que la solution claire d'origine, pas de réel changement de couleur. (Substrat élevé, dilué, faible teneur en enzymes)

*Un Dh20 inférieur et des concentrations d'extrait de pomme de terre plus élevées ont permis un temps de réaction plus rapide

Tableau 4. Concentrations de la solution, pH du tampon, volumes et observations pour l'expérience 4 : L'effet du pH sur l'activité enzymatique.

pH tamponVolume tampondH2Extrait de pomme de terrecatécholObservations
42 ml3 ml500μl500μlBlanc nuageux
62 ml3 ml500μl500μlJaune foncé
82 ml3 ml500μl500μLBrun orangé
102 ml3 ml100μl500μlPêche translucide

*La vitesse de réaction augmentait avec l'augmentation du pH, un pH de 6 étant le meilleur tampon pour l'activité catéchol oxydase. L'augmentation du pH au-delà de 6 a montré une diminution de la vitesse de réaction.

Tableau 5. Concentrations, températures, volumes et observations des solutions pour l'expérience 5 : L'effet de la température sur l'activité enzymatique.

Tube à essaidH2Extrait de pomme de terrecatécholObservations
1 (0°C)5 ml500μl500μlBrun jaunâtre très clair
2 (15°C)5 ml500μl500μlPêche jaunâtre
3 (37°C)5 ml500μl500μLOrange-pêche
4 (100°C)5 ml500μl500μlPêche très clair

*La vitesse de réaction la plus rapide a été observée à 37°C. Plus la température est froide (0°C – 15°C), plus la vitesse de réaction est lente. La dénaturation de l'enzyme a été observée à 100°C.

Tableau 6. Concentrations, volumes et observations de solution pour l'expérience 6 : Effets inhibiteurs – Inhibition de l'action de la catéchol oxydase

Tube à essaidH2Extrait de pomme de terrePTUcatécholObservations
15 ml + 1 ml500μl—–500μlPêche jaunâtre (Contrôle)
25ml + 500μL500μl500μl500μlPêche très clair
35 ml500μl500μl500μLNuageux, blanc clair

*La réaction la plus rapide et la plus prononcée a été observée dans le tube 1 (la solution sans phénylthiourée)

Discussion de laboratoire d'enzymes

Pour la première expérience, Observing the Enzyme Reaction, il a été émis l'hypothèse que la réaction enzymatique ne se produirait que dans le deuxième tube à essai en raison du fait que c'était le seul tube à contenir à la fois l'enzyme et le substrat. Comme prévu, la solution dans le tube 2 était la seule solution à montrer le pigment jaune-brun caractéristique de la production de benzoquinone, qui était causé par l'extrait de pomme de terre convertissant son catéchol en le nouveau produit.

Dans l'expérience 2, L'effet de la concentration de substrat sur l'activité enzymatique, l'hypothèse était que le tube avec la concentration de substrat la plus élevée montrerait une réaction chimique plus rapide et plus prononcée que le tube avec moins de catéchol.

L'hypothèse était étayée par le fait que la concentration plus élevée de catéchol dans le tube 1 permettait un résultat similaire au tube 2 de l'expérience 1, la seule différence étant que les 5 ml supplémentaires de dH20 a dilué une partie de la couleur brun jaunâtre observée lors de la première réaction.

Bien qu'il y ait eu une réaction chimique observée dans le tube 2 (expérience 2), elle était beaucoup plus lente (avec un pigment de pêche translucide) en raison d'une concentration plus faible en catéchol et d'un dH plus élevé.20 concentration. Plus la concentration de catéchol est élevée, plus la production de benzoquinone peut être importante.

Il a été émis l'hypothèse dans l'expérience 3, L'effet de la concentration enzymatique sur l'activité enzymatique, que plus la concentration d'enzyme dans la solution est élevée, plus la réaction chimique serait rapide et prononcée.

Cette hypothèse a pu être acceptée sur la base de la vitesse à laquelle le tube avec la concentration d'extrait de pomme de terre la plus élevée a réagi. Le tube 1 contenait 400 L d'extrait de pomme de terre en plus et 400 μL de dH en moins20 que le tube 2. Parce que les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui accélèrent le temps de réaction chimique, la solution dans le tube 1 est rapidement passée d'un pigment bleu-vert à la couleur brun jaunâtre associée à la benzoquinone.

La concentration plus faible d'extrait de pomme de terre et une concentration plus élevée de dH20 dans le tube 2 n'ont montré aucun changement de couleur, autre que le trouble de l'extrait de pomme de terre lui-même.

Dans l'expérience 4, L'effet du pH sur l'activité enzymatique, l'hypothèse initiale était que plus le niveau de pH du tampon ajouté à la solution était bas, plus la vitesse de réaction serait rapide. Cette hypothèse n'était pas étayée par les données observées car des niveaux d'acidité plus élevés ralentissaient en fait la production de benzoquinone, ce qui était le contraire de ce qui était prédit.

La solution avec un tampon de pH 4 est restée d'un blanc trouble, tandis que la solution avec un tampon de pH 6 a viré au brun jaunâtre. À mesure que le pH augmentait, le taux de production de benzoquinone augmentait. Alors que les tampons à pH inférieur se sont avérés trop acides, des tampons plus neutres ont permis le meilleur environnement pour l'activité de la catéchol oxydase.

Les niveaux de pH du tampon supérieurs à 6 ont également montré une réaction chimique plus lente et moins prononcée, illustrant le besoin de neutralité de la réaction enzymatique.

L'hypothèse de l'expérience 5, L'effet de la température sur l'activité enzymatique, était qu'une température extrêmement basse ralentirait le taux de production de benzoquinone, tandis que des températures extrêmement élevées entraîneraient la dénaturation des enzymes. Cette hypothèse était étayée par la vitesse à laquelle les solutions à 0°C – 15°C réagissaient lentement, et la vitesse à laquelle la solution à 37°C produisait rapidement de la benzoquinone.

Après cinq minutes à la température désignée de chaque solution, les solutions les plus froides ont à peine commencé à changer de couleur, tandis que les températures les plus chaudes ont rapidement réagi – à tel point qu'à 100°C, les enzymes se sont dénaturées et la solution a commencé à pâlir de pigment. Des températures plus froides ont ralenti le mouvement des molécules dans les solutions, tandis que des températures plus chaudes (sans compter 100 °C) ont permis un meilleur environnement pour l'activité de la catéchol oxydase.

Pour l'expérience 6, Effets inhibiteurs - Inhibition de l'action de la catéchol oxydase, il a été émis l'hypothèse que l'ajout de phénylthiourée (PTU) empêcherait la réaction enzymatique de se produire. L'hypothèse a pu être acceptée du fait que les tubes qui contenaient le PTU présentaient très peu de changement de pigment.

Le tube 1 a servi de témoin, qui a montré la production de benzoquinone (couleur brun jaunâtre) et a permis une comparaison entre les trois solutions. Considérant que le PTU est un inhibiteur non compétitif, les tubes 2 et 3 contenaient des solutions qui empêchaient l'enzyme de catalyser la réaction, que le substrat soit ou non lié au site actif.

Le seul vrai problème avec l'une des 6 expériences était l'hypothèse non étayée de l'effet du pH sur l'expérience de l'activité enzymatique. J'ai dû lier la nature conservatrice de la benzoquinone à la façon dont le jus de citron acide empêche les pommes de brunir, j'ai donc supposé qu'un pH bas augmenterait la vitesse de réaction. En réalité, l'acidité ralentit la vitesse de réaction - ce qui est Pourquoi les pommes ne changent pas de couleur.

En conclusion, ces expériences ont montré que la production de benzoquinone ne peut se produire qu'avec la présence à la fois d'une enzyme et d'un substrat. Des facteurs tels que la concentration de substrat et d'enzyme, le pH, la température et la présence d'inhibiteurs non compétitifs peuvent affecter la réaction enzymatique. Une concentration élevée de substrat permettra une plus grande production de benzoquinone, tandis qu'une concentration élevée d'enzymes accélérera la vitesse de réaction - et vice versa.

Pour que la réaction enzymatique se produise rapidement, elle doit être effectuée dans un environnement où le pH est aussi proche que possible de la neutralité, la vitesse de réaction ralentissant à la fois dans les solutions très acides ou basiques. Il en va de même pour la température – des températures extrêmement élevées ou extrêmement froides peuvent réduire les taux de réaction enzymatique ou entraîner la dénaturation complète des enzymes.

L'introduction d'un inhibiteur non compétitif (comme la phénylthiourée) lui permet de se lier au site allostérique de l'enzyme, ce qui empêche la réaction de se produire (quelle que soit la concentration en enzyme ou en substrat).


Résultats

Fonctionnalités de compilation pour l'apprentissage automatique

Afin de construire des modèles ML prédictifs des taux de renouvellement catalytique des enzymes, nous avons compilé un ensemble diversifié de caractéristiques qui incluent les propriétés du réseau, les propriétés structurelles des enzymes, les informations sur les mécanismes biochimiques et les conditions de dosage (Fig. 1, détails dans Méthodes et Tableau supplémentaire 2).

Apprentissage automatique des chiffres du chiffre d'affaires catalytique pour la paramétrisation du modèle métabolique à l'échelle du génome (GEM). Un ensemble de fonctionnalités de diverses classes est organisé et mappé pour créer indépendamment des modèles d'apprentissage automatique (ML) des deux kchat in vitro (F(X)) et kapplication, max in vivo (g(X)). Les modèles ML inférés sont utilisés pour prédire kchat in vitro ou kapplication, max à l'échelle du génome pour paramétrer les GEM

Les propriétés du réseau ont été extraites d'un GEM de E. coli K-12 MG1655, jeML1515 26 : Le flux moyen dans diverses conditions de croissance a été obtenu avec une approche d'échantillonnage Monte Carlo et un FBA 27 parcimonieux (voir Méthodes). La propension d'un composant enzymatique à participer à de multiples réactions - la propriété généraliste - s'est avérée dans le passé associée à des taux de renouvellement catalytique plus faibles 28 . Nous avons ainsi quantifié la tendance d'une enzyme à catalyser des réactions multiples à partir des règles de réaction gène-protéine (GPR) de jeML1515. De plus, le nombre de substrats enzymatiques a été extrait de la matrice stoechiométrique de jeML1515.

Nous avons émis l'hypothèse que les propriétés structurelles des enzymes contiennent des informations sur les constantes de renouvellement catalytique. À cette fin, nous avons extrait les propriétés structurelles enzymatiques des structures protéiques de la Protein Data Bank 29 et des modèles d'homologie du pipeline de modélisation I-TASSER 30,31 (voir Méthodes). Le désordre structurel global et le poids moléculaire ont été utilisés comme caractéristiques du modèle ML. L'occurrence relative des classes de structures secondaires est fortement corrélée avec la fraction de désordre structurel, et nous avons décidé de ne pas les inclure dans le modèle ML pour éviter les caractéristiques colinéaires. Nous nous attendions en outre à ce que les propriétés de la structure du site catalytique soient particulièrement informatives sur le renouvellement enzymatique et avons donc extrait les informations sur le site catalytique de l'Atlas des sites catalytiques 32 . En particulier, nous avons utilisé la profondeur du site actif, l'exposition au solvant du site actif, l'hydrophobie du site actif, le nombre de résidus contribuant au site actif et la structure secondaire du site actif comme caractéristiques du modèle (voir le tableau supplémentaire 1 pour plus de détails).

De plus amples informations sur la biochimie enzymatique ont été incluses sous la forme de nombres EC, d'efficacité thermodynamique, de constantes de Michaelis (Kms) et les concentrations de métabolites (voir Méthodes).

Pour les modèles ML d'in vitro kchats nous avons inclus le pH et la température du test comme caractéristiques du modèle pour corriger ces conditions de test.

Comme aucune corrélation convaincante entre les propriétés des propriétés structurelles du substrat enzymatique et in vitro kchat a été trouvé précédemment 15, nous avons décidé de ne pas inclure les propriétés structurelles du substrat comme caractéristiques.

Compiler les données de sortie pour l'apprentissage automatique

Traditionnellement, les chiffres de renouvellement catalytique enzymatique sont mesurés dans des tests biochimiques in vitro, une quantité que nous appelons kchat in vitro. Nous avons extrait des informations sur kchat in vitro pour E. coli des bases de données BRENDA 33 , SABIO-RK 34 et Metacyc 35 (Figure supplémentaire 1). Ces valeurs extraites ont été filtrées pour éviter les enzymes de type non sauvage, les substrats non physiologiques et la redondance entre les bases de données (voir Méthodes pour plus de détails). En plus des mesures in vitro, nous avons utilisé des estimations in vivo du renouvellement enzymatique efficace, kapplication, max, qui ont été obtenus en tant que taux de rotation effectif maximum dans diverses conditions de croissance 14 . L'ensemble de données final contient 215 observations complètes, c'est-à-dire que toutes les caractéristiques et toutes les sorties sont disponibles, pour kchat in vitro et 133 observations complètes pour kapplication, max (Figure supplémentaire 2) comme indiqué ci-dessous, cet ensemble peut être étendu par imputation de caractéristiques sélectionnées, produisant 497 et 234 observations complètes pour kchat in vitro et kapplication, max, respectivement.

Formation de modèles prédictifs des nombres de renouvellement d'enzymes

Nous avons utilisé l'ensemble de fonctionnalités compilé pour entraîner séparément les modèles de ML pour kchat in vitro et kapplication, max (Fig. 1). Un ensemble diversifié d'algorithmes de régression a été formé à l'aide d'une validation croisée répétée quintuple (voir Méthodes et Tableau supplémentaire 2). Nous constatons que le choix de l'algorithme n'a qu'un faible effet sur les performances du modèle, où la moyenne croisée validée R 2 entre les prédictions et la validation a tendance à être plus faible dans les techniques de modélisation linéaire (régression linéaire, PLSR, filet élastique) par rapport aux modèles plus complexes (forêt aléatoire et réseau de neurones profonds) pour le kchat modèles in vitro (Fig. 2). La performance prédictive des modèles est significativement plus élevée pour kapplication, max que pour kchat in vitro, montrant une moyenne croisée validée R 2 s de 0,76 et 0,31, respectivement (Fig. 2, voir la figure supplémentaire 3 pour les erreurs quadratiques moyennes (RMSE)). L'estimation des performances du modèle par validation croisée peut être biaisée positivement car les hyperparamètres sont optimisés dans le processus, mais l'utilisation d'un ensemble de tests indépendant confirme nos résultats (Fig. 2). On attend donc des modèles de kapplication, max être plus approprié pour prédire les taux de renouvellement catalytique à l'échelle du génome.

Performances du modèle d'apprentissage automatique pour kapplication, max et kchat in vitro. Les lignes centrales indiquent la médiane R 2 sur cinq validations croisées répétées cinq fois (25 validations), à l'exception du cas de l'apprentissage en profondeur, où la médiane pour un seul cycle de validation croisée cinq fois (cinq validations) est indiquée. Les limites de la boîte représentent les 1er et 3e quartiles, les moustaches s'étendent à des valeurs comprises dans l'intervalle interquartile 1,5x et les points restants sont affichés comme des valeurs aberrantes (marqués x). Les cercles montrent R 2 pour un ensemble de tests composé de 20 % des échantillons disponibles qui n'ont pas été utilisés pour l'optimisation des hyperparamètres. Cela a abouti à un ensemble de formation de 172 observations de kchat in vitro et 106 observations de kapplication, max. Pour l'ensemble de test, 43 et 27 observations ont été utilisées pour kchat in vitro et kapplication, max, respectivement. Voir Méthodes pour plus de détails sur l'optimisation des hyperparamètres

Les modèles présentent une similitude dans l'importance des caractéristiques

Bien que les modèles ML de kapplication, max atteint une précision de prédiction supérieure à celle de kchat in vitro, les deux modèles sont capables d'expliquer une variation significative des taux de renouvellement catalytique de notre ensemble de caractéristiques. Quelles caractéristiques contribuent le plus à ces prédictions ? Nous avons analysé l'importance des caractéristiques dans les modèles de forêt aléatoire en examinant l'augmentation moyenne de l'erreur quadratique moyenne qui résulte de la permutation aléatoire d'un vecteur de caractéristiques respectif sur 500 arbres de décision formés (Fig. 3).

Importance des caractéristiques dans les modèles de forêts aléatoires pour les chiffres de renouvellement in vivo et in vitro. L'importance relative telle que mesurée par la diminution moyenne de l'erreur quadratique moyenne (MSE) hors sac à travers les arbres qui résulte de la permutation aléatoire d'une caractéristique donnée (mise à l'échelle par l'écart type) est indiquée. Les barres manquantes indiquent une importance de permutation inférieure ou égale à zéro. La signification statistique de l'importance des caractéristiques a été évaluée à l'aide d'un test de permutation basé sur 500 permutations de la variable de réponse par modèle *p-valeur < 0.05, **p-valeur < 0,005. La corrélation de rang de Spearman entre les estimations d'importance des deux modèles est de 0,47 (p < 0.021, m = 24, S = 1214, voir Méthodes), en ignorant les caractéristiques liées au dosage qui ne sont pas utilisées dans le modèle pour kapplication, max

Nous constatons que l'importance des caractéristiques est significativement corrélée entre les modèles pour kchat in vitro et in vivo kapplication, max (corrélation Spearman Rank 0,46, p < 0.025, m = 24, S = 1214, voir Méthodes). Le flux in silico est la caractéristique la plus importante à la fois in vitro kchat et in vivo kapplication, max, confirmant le rôle important supposé de la pression de sélection évolutive sur les chiffres de renouvellement enzymatique 5,15,17 . Nous avons confirmé ce rôle important du flux en utilisant des flux basés sur des données expérimentales d'analyse de flux métabolique (AMF) au lieu de flux in silico, conduisant à des performances de modèle très similaires (Figure supplémentaire 5, voir Méthodes). De même, la caractéristique généraliste est un contributeur important dans les deux modèles. Les caractéristiques structurelles sont d'une importance constante dans les deux modèles, avec la profondeur du site actif, l'accessibilité au solvant du site actif et l'exposition du site actif montrant des contributions significatives dans les deux modèles. Fait intéressant, l'enzyme Km est une caractéristique très importante dans le kchat modèle in vitro, mais ne donne aucun avantage prédictif dans le modèle pour kapplication, max. Cet effet pourrait être dû à l'original kapplication, max estimation étant biaisée en ce qui concerne la saturation enzymatique.

Les modèles d'apprentissage automatique améliorent les prédictions du protéome

Un obstacle majeur à l'utilisation des GEM d'investissement protéique est l'exigence de milliers de constantes de taux de renouvellement d'enzymes spécifiques à la direction (plus de 3000 en jeML1515), alors que les ensembles de données in vitro et in vivo sont limités à quelques centaines de ces mesures (497 et 234, respectivement, couvrant 412 et 234 réactions, respectivement Figure supplémentaire 2).

La haute précision à validation croisée des modèles ML pour kapplication, max (Fig. 2) suggère que ces modèles statistiques pourraient être utilisés pour prédire la kapplication, max des processus métaboliques à l'échelle du génome pour améliorer la précision prédictive des GEM mécanistes. Pour atteindre cet objectif, nous avons créé un modèle d'ensemble pour kapplication, max qui combine les prédictions de trois modèles ML différents : le réseau élastique linéaire, le modèle de forêt aléatoire basé sur un arbre de décision et le modèle de réseau neuronal complexe (voir Méthodes et Tableau supplémentaire 2 pour plus de détails). Le réseau élastique linéaire devrait présenter une faible variance au prix d'un biais plus élevé, tandis que les deux algorithmes plus complexes, la forêt aléatoire et le réseau de neurones, sont plus susceptibles de sur-ajuster sur l'ensemble de données relativement petit 36 ​​. Nous avons confirmé ce comportement en calculant des courbes d'apprentissage (Figure supplémentaire 4). L'apprentissage du modèle et les prédictions à l'échelle du génome sont limités par le nombre d'observations de caractéristiques disponibles pour chaque réaction, ce qui suggère que l'imputation des observations de caractéristiques manquantes peut conduire à des modèles ML plus précis (Figure supplémentaire 2). Pour chacun des trois algorithmes ML, nous avons donc entraîné quatre versions : une sans imputation, une avec imputation de l'ensemble d'apprentissage, une avec imputation des seules caractéristiques sur lesquelles sont basées les prédictions et une où toutes les observations sont imputées (voir Méthodes pour plus de détails ). Dans les cas où les observations contenaient des valeurs manquantes qui n'ont pas été imputées, la médiane de toutes les prédictions réussies a été utilisée. La diversité de ces modèles ML se reflète dans la corrélation modeste de leurs prédictions (moyenne R 2 entre les prédictions est de 0,27 pour kapplication, max et 0,08 pour kchat in vitro) suggérant qu'une approche d'ensemble peut améliorer la précision du modèle ML. Nous avons donc utilisé la prédiction moyenne sur ces douze modèles comme modèle d'ensemble final. Données expérimentales sur kapplication, max et kchat in vitro a ensuite été extrapolée à l'échelle du génome en utilisant le modèle d'ensemble respectif.

Les chiffres de renouvellement catalytique des enzymes affectent fortement le coût protéomique des flux de réaction. La performance prédictive des GEM pour l'allocation quantitative du protéome devrait donc être sensible à l'ensemble des taux de renouvellement effectifs. Nous avons utilisé deux cadres de modélisation GEM différents, la modélisation métabolique avec cinétique enzymatique (MOMENT) 5 et un GEM du métabolisme et de l'expression génique (modèle ME) 8,9, pour prédire les données de protéomique quantitative 37 et pour comparer les performances prédictives à travers différentes paramétrisations à l'échelle du génome stratégies : connues in vitro kchat avec les valeurs manquantes simplement remplacées par la médiane des valeurs connues (médiane-imputée), in vitro kchat extrapolé avec le modèle d'ensemble ML, médiane imputée kapplication, max, et kapplication, max extrapolé avec le kapplication, max Modèle d'ensemble ML (Fig. 4). De plus, nous avons également inclus une paramétrisation avec un ajustement de keff paramètres aux données de protéomique qui a été menée plus tôt pour étudier la régularité de keffs 12 . La principale différence entre l'algorithme MOMENT et le modèle ME réside dans le fait que les modèles ME modélisent explicitement les détails de la machinerie d'expression génique et de la synthèse des co-facteurs, ce qui donne une représentation plus réaliste de la stoechiométrie du complexe enzymatique et de la dilution du produit génique dépendant du taux de croissance. .

Performance des vecteurs de chiffres de renouvellement catalytique dans la prédiction des données quantitatives du protéome. Les performances de deux cadres de modélisation métabolique à l'échelle du génome différents, MOMENT et le modèle ME, sont présentées. Les prédictions du modèle sont comparées aux données quantitatives de protéomique dans Schmidt et al. 37 à travers l'erreur quadratique moyenne (RMSE) pour les fractions métaboliques du protéome sur une échelle log10. Les comparaisons utilisent des protéines qui se trouvent à la fois dans les données de protéomique et sont exprimées dans les prédictions du modèle. Pour permettre la comparaison de différentes stratégies de paramétrisation, l'intersection des ensembles de protéines comparables est utilisée dans chaque combinaison condition-modèle résultant en le nombre de comparaisons m. Les performances des deux cadres de modélisation, MOMENT et ME, ne sont donc pas comparables, car différents ensembles de protéines sous-tendent les calculs d'erreur. Voir les méthodes et la figure supplémentaire 8 pour plus de détails

Nous constatons que la capacité prédictive du modèle MOMENT et du modèle ME est plus élevée pour kapplication, max-basés sur des jeux de paramètres que pour ceux basés sur kchat in vitro, où l'erreur de prédiction est en moyenne 43 % plus faible dans MOMENT et également 43 % plus faible dans le modèle ME. Le modèle ML d'ensemble améliore encore les performances prédictives de kapplication, maxGEMs basés de manière cohérente dans les conditions de croissance et les techniques de modélisation mécaniste, avec une réduction moyenne de l'erreur quadratique moyenne (RMSE) de 34 % et 20 % pour MOMENT et le modèle ME, respectivement (Fig. 4). Comme attendu des erreurs de validation croisée élevées pour les modèles ML de kchat in vitro (Fig. 2), le gain de performance qui provient du modèle ML d'ensemble pour kchat in vitro est bien inférieur à celui de la kapplication, max Modèle ML, avec une réduction moyenne du RMSE de 7 % pour les modèles MOMENT et de 1 % pour les modèles ME (Fig. 4).


L'inhibiteur enzymatique conduit à un taux de renouvellement plus élevé? - La biologie

Cette page examine l'effet des inhibiteurs sur les réactions impliquant des enzymes. Ceci est la troisième et dernière page expliquant comment les enzymes fonctionnent comme catalyseurs. N'oubliez pas que cette série de pages est écrite pour les 16 - 18 ans chimie étudiants. Si vous voulez quelque chose de plus avancé, vous cherchez au mauvais endroit.

Noter: Cette page suppose que vous avez déjà lu la page sur le fonctionnement des protéines en tant qu'enzymes. Si vous êtes arrivé directement sur cette page via un moteur de recherche, vous devriez vraiment revenir en arrière et lire cette page en premier. En fait, à moins que vous n'ayez déjà une bonne connaissance de la structure des protéines, vous devrez peut-être remonter encore plus loin à une page sur la structure des protéines.

Inhibition compétitive et non compétitive

Inhibiteurs compétitifs

C'est la forme la plus simple et la plus évidente d'inhibition enzymatique - et le nom vous dit exactement ce qui se passe.

L'inhibiteur a une forme similaire au substrat habituel de l'enzyme et entre en compétition avec lui pour le site actif. Cependant, une fois qu'il est attaché au site actif, il ne lui arrive rien. Il ne réagit pas - essentiellement, il ne fait que gêner.

Vous vous souvenez de l'équation générale d'une enzyme réagissant avec un substrat ?

L'équation équivalente pour un inhibiteur compétitif ressemble à ceci :

Le complexe ne réagit plus pour former des produits - mais sa formation est toujours réversible. Il se décompose à nouveau pour former l'enzyme et la molécule inhibitrice.

Cela signifie que si vous augmentez la concentration du substrat, le substrat peut concurrencer l'inhibiteur, et ainsi la réaction normale peut avoir lieu à une vitesse raisonnable.

Un exemple simple de ceci implique des ions malonate inhibant l'enzyme succinate déshydrogénase. Cette enzyme catalyse la conversion des ions succinate en ions fumarate. Les noms modernes sont :

La conversion effectuée par la succinate déshydrogénase est :

La réaction est inhibée par les ions malonate qui ont une forme très similaire aux ions succinate.

La forme similaire permet aux ions malonate de se lier au site actif, mais l'absence de CH2-CH2 la liaison au centre de l'ion arrête toute autre réaction.

Les ions malonate bloquent donc le site actif - mais n'oubliez pas que c'est réversible. Les ions malonate se détacheront et libéreront à nouveau l'enzyme. Les ions malonate sont en compétition pour le site - ils ne le détruisent pas.

Si les ions succinate ont une concentration plus élevée que les ions malonate, ils auront par chance accès au site plus souvent que les ions malonate. Cela signifie que vous pouvez surmonter l'effet d'un inhibiteur compétitif en augmentant la concentration du substrat.

Noter: Certains biochimistes sont très négligents quant à l'utilisation des noms chimiques ! Si vous lisez sur cette réaction dans d'autres endroits, vous pouvez trouver la réaction citée comme convertissant l'acide succinique en acide fumarique. Certaines sources semblent même impliquer que les mots "succinate" et "acide succinique" signifient la même chose. C'est inacceptable d'un point de vue chimique !

Pour autant que j'ai pu le découvrir, la version correcte est la conversion des ions succinate en ions fumarate (comme ci-dessus). À un pH cellulaire typique d'environ pH 7, ces substances seront présentes principalement sous forme d'ions, et non sous forme d'acides non ionisés. Et les articles scientifiques de personnes travaillant sur les mécanismes de cette conversion parlent tous des ions, pas des acides.

Inhibiteurs non compétitifs

Un inhibiteur non compétitif ne se fixe pas au site actif, mais se fixe ailleurs sur l'enzyme. En se fixant ailleurs, il affecte la structure de l'enzyme et donc la façon dont l'enzyme fonctionne. Because there isn't any competition involved between the inhibitor and the substrate, increasing the substrate concentration won't help.

If you look at various biochemistry sites on the web, you will find two explanations for this. We'll look at the simple, fairly obvious one in some detail in a minute. I want to have a brief word about the other one first.

"Pure" non-competitive inhibitors

This explanation says that the inhibitor doesn't affect the ability of the substrate to bond with the active site, but stops it reacting once it is there.

I found a couple of biochemistry sites which said that inhibitors working like this (which they describe as pure non-competitive inhibitors) are virtually unknown. As a non-biochemist, I don't know what the truth is about this - if you want to find out, you will probably have to do a biochemistry degree!

Other non-competitive inhibitors

The straightforward explanation (which would seem to apply to most enzymes) is that reaction with the inhibitor causes the shape of the active site to change. Remember that non-competitive inhibitors aren't attaching directly to the active site, but elsewhere on the enzyme.

The inhibitor attachs to a side group in the protein chain, and affects the way the protein folds into its tertiary structure. That in turn changes the shape of the active site. If the shape of the active site changes, then the substrate can't attach to it any more.

Some non-competitive inhibitors attach irreversibly to the enzyme, and therefore stop it working permanently. Others attach reversibly.

A relatively uncomplicated example of non-competitive inhibitors in a reasonably familiar situation is:

Heavy metal poisoning

You are probably aware that compounds containing heavy metals such as lead, mercury, copper or silver are poisonous. This is because ions of these metals are non-competitive inhibitors for several enzymes.

I'm going to take silver as a simple example.

Silver ions react with -SH groups in the side groups of cysteine residues in the protein chain:

There isn't enough electronegativity difference between silver and sulphur for a full ionic bond and so the bond can be considered as covalent.

If the cysteine residue is somewhere on the protein chain which affects the way it folds into its tertiary structure, then altering this group could have an effect on the shape of the active site, and so stop the enzyme from working.

The 2+ ions from, for example, mercury, copper or lead can behave similarly - also attaching themselves to the sulphur in place of the hydrogen.

Noter: I have come across a couple of references to the ability of heavy metal ions to break sulphur-sulphur bridges, which would have a major effect on the folding of the protein chain.

A student suggested this page, which has a note about mercury poisoning (see item 4 on the page). This suggests that mercury breaks sulphur-sulphur bridges by attaching to both of the sulphur atoms, distorting the bridge, and so the folding of the protein chains. I have no reason to suppose that this description is wrong, but I am a bit wary of relying on a single source.

The reason for choosing silver as my example rather than the more obvious mercury or lead is that it forms a 1+ ion. For 2+ ions, you would have to worry about what got attached to the metal as well as the sulphur - or whether it retained a single positive charge. All the biochemistry sources I've been able to find skip over this problem - as a chemistry teacher looking for chemical accuracy, I'm not prepared to do that!

Des questions pour tester votre compréhension

S'il s'agit de la première série de questions que vous posez, veuillez lire la page d'introduction avant de commencer. Vous devrez utiliser le BOUTON RETOUR de votre navigateur pour revenir ici par la suite.


The choice of a competitive or non-competitive inhibitor as a drug

If the requirement is to increase the intracellular concentration of the substrate, then either a competitive or non-competitive inhibitor will serve, since both will inhibit the utilisation of substrate, so that it accumulates.

However, if the requirement is to decrease the intracellular concentration of the product, then the inhibitor must be non-competitive. As unused substrate accumulates, so it will compete with a competitive inhibitor, and the final result will be a more or less normal rate of formation of product, but with a larger pool of substrate. Increasing the concentration of substrate does not affect a non-competitive inhibitor.


Résumé

The rate of product formation is an important measure of the speed of enzyme reactions. Classical studies of enzyme reactions have been conducted in dilute solutions and under conditions that justified the substrate abundance assumption. However, such assumption is well-known to break down in the context of cellular biochemistry. Instead, the concentration of available substrate can become rate limiting. Here we use the chemical master equation to obtain expressions for the instantaneous and time averaged rate of product formation without invoking the conventional substrate abundance assumption. The expressions are derived for a broad range of enzyme reaction mechanisms, including those that involve one or many enzyme molecules, require multiple substrates, and exhibit cooperativity and substrate inhibition. Novel results include: (i) the relationship between the average rate of product formation (calculated over the time it takes for the reaction to finish) and the substrate concentration, for a Michaelis–Menten (MM) reaction with one enzyme molecule, is approximately given by a logarithmically corrected MM form (ii) intrinsic noise decreases the sharpness of cooperative switches but enhances the filtering response of substrate inhibition (iii) the relationship between the initial average rate of product formation and the initial substrate concentration for a MM reaction with no reversible reaction and with any number of enzyme and substrate molecules is a sum of Michaelis–Menten equations.


The Significance of (K_M) and (V_)

The Michaelis-Menten model is used in a variety of biochemical situations other than enzyme-substrate interaction, including antigen-antibody binding, DNA-DNA hybridization, and protein-protein interaction. It can be used to characterize a generic biochemical reaction, in the same way that the Langmuir equation can be used to model generic adsorption of biomolecular species. When an empirical equation of this form is applied to microbial growth. The experimentally determined parameters values vary wildly between enzymes (Table (PageIndex<1>)):

Table (PageIndex<1>) : Enzyme Kinetic parameters
Enzyme (K_m) (M) (k_) (1/s) (k_/K_m) (1/M.s)
Chymotrypsin 1.5 × 10 &minus2 0.14 9.3
Pepsine 3.0 × 10 &minus4 0.50 1.7 × 10 3
Tyrosyl-tRNA synthetase 9.0 × 10 &minus4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonuclease 7.9 × 10 &minus3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Carbonic anhydrase 2.6 × 10 &minus2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 &minus6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

While (K_m) is equal to the substrate concentration at which the enzyme converts substrates into products at half its maximal rate and hence is related to the affinity of the substrate for the enzyme. The catalytic rate (k_) is the rate of product formation when the enzyme is saturated with substrate and therefore reflects the enzyme's maximum rate. The rate of product formation is dependent on both how well the enzyme binds substrate and how fast the enzyme converts substrate into product once substrate is bound. For a kinetically perfect enzyme, every encounter between enzyme and substrate leads to product and hence the reaction velocity is only limited by the rate the enzyme encounters substrate in solution. From Equation ( ef), the catalytic efficiency of a protein can be evaluated.

This (k_/K_m) ratio is called the specificity constant measure of how efficiently an enzyme converts a substrate into product. It has a theoretical upper limit of 10 8 &ndash 10 10 /M.s enzymes working close to this, such as fumarase, are termed superefficient (Table (PageIndex<1>)).

Determining (V_m) and (K_m) from experimental data can be difficult and the most common way is to determine initial rates, (v_0), from experimental values of ([P]) or ([S]) as a function of time. Hyperbolic graphs of (v_0) vs. ([S]) can be fit or transformed as we explored with the different mathematical transformations of the hyperbolic binding equation to determine (K_d). Ceux-ci comprenaient :

  • nonlinear hyperbolic fit (e.g., Figure (PageIndex<1>))
  • double reciprocal plot (e.g., Lineweaver&ndashBurk plot discussed below
  • Eadie-Hofstee plot

Enzyme inhibitors are substances which alter the catalytic action of the enzyme and consequently slow down, or in some cases, stop catalysis. There are three common types of enzyme inhibition - competitive, non-competitive and substrate inhibition.

Most theories concerning inhibition mechanisms are based on the existence of the enzyme-substrate complex ES. As mentioned earlier, the existence of temporary ES structures has been verified in the laboratory.

Competitive inhibition occurs when the substrate and a substance resembling the substrate are both added to the enzyme. A theory called the "lock-key theory" of enzyme catalysts can be used to explain why inhibition occurs.

The lock and key theory utilizes the concept of an "active site." The concept holds that one particular portion of the enzyme surface has a strong affinity for the substrate. The substrate is held in such a way that its conversion to the reaction products is more favorable. If we consider the enzyme as the lock and the substrate the key (Figure 9) - the key is inserted in the lock, is turned, and the door is opened and the reaction proceeds. However, when an inhibitor which resembles the substrate is present, it will compete with the substrate for the position in the enzyme lock. When the inhibitor wins, it gains the lock position but is unable to open the lock. Hence, the observed reaction is slowed down because some of the available enzyme sites are occupied by the inhibitor. If a dissimilar substance which does not fit the site is present, the enzyme rejects it, accepts the substrate, and the reaction proceeds normally.

Non-competitive inhibitors are considered to be substances which when added to the enzyme alter the enzyme in a way that it cannot accept the substrate. Figure 10.

Substrate inhibition will sometimes occur when excessive amounts of substrate are present. Figure 11 shows the reaction velocity decreasing after the maximum velocity has been reached.

Additional amounts of substrate added to the reaction mixture after this point actually decrease the reaction rate. This is thought to be due to the fact that there are so many substrate molecules competing for the active sites on the enzyme surfaces that they block the sites (Figure 12) and prevent any other substrate molecules from occupying them.

This causes the reaction rate to drop since all of the enzyme present is not being used.


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Science

Vol 371, Issue 6528
29 January 2021

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